均勻設(shè)計優(yōu)化京萬紅超臨界萃取工藝研究

艾慶波，趙　宇，國大亮*，黃秋霞，潘　超，劉玉璇

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300071；2.天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300000)

京萬紅是家喻戶曉的外用復(fù)方中藥油膏制劑，廣泛用于燒傷、瘡瘍、刀傷、外傷和創(chuàng)面潰瘍等癥的治療[1]。京萬紅的原提取工藝為高溫油浸，其熱敏有效成分易損失。超臨界萃取技術(shù)多用于單味藥材的提取，本研究首次將超臨界萃取技術(shù)用于京萬紅大復(fù)方，低溫提取京萬紅處方中的中低極性成分，以均勻設(shè)計優(yōu)化萃取工藝參數(shù)，為京萬紅的現(xiàn)代中成藥二次開發(fā)提供試驗基礎(chǔ)[2-3]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

紫草、白芷、地榆、地黃、當(dāng)歸等26種飲片均由天津市達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供；色譜乙腈，F(xiàn)isher公司；無水乙醇，天津北方化學(xué)試劑有限公司；磷酸，天津市華東試劑廠；冰醋酸，天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧，中國藥品生物制品檢定所(批號111689-200501)；異歐前胡素，中國藥品生物制品檢定所(批號110827- 200407)。

1.2　儀器與設(shè)備

HA220-50-06型超臨界萃取裝置，江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；Agilent 1200液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；LD1000-1電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。

1.3　京萬紅超臨界萃取工藝流程

用1 L萃取釜，在釜底墊脫脂棉且用紗布包裹鋪平，將287 g京萬紅復(fù)方粗粉(過1號篩)與夾帶劑拌勻裝于釜中鋪平，在萃取釜出口墊脫脂棉且用紗布包裹鋪平后加萃取釜蓋，擰緊后將萃取釜放于CO2超臨界裝置中。啟動超臨界裝置后設(shè)定操作參數(shù)，達(dá)到提取溫度后平衡30 min，分離溫度比提取溫度高5 ℃，啟動CO2泵，升壓待試驗壓力達(dá)到要求后，維持萃取條件20 min，繼后打開分離釜閥門，維持萃取條件不變，每間隔10 min從分離釜中接收1次萃取物，稱重，直至萃取物重量恒重時停止試驗。

1.4　萃取工藝的均勻設(shè)計

1.5　驗證試驗

通過回歸方程分析，得出最適宜的工藝條件，根據(jù)最適宜條件進行試驗，重復(fù)3 次。

1.6　β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧的測定

1.6.1色譜條件[6]

Kromasil C184.6×250 mm，流速1 mL/min，流動相為乙腈-水-磷酸(600∶400∶5)，檢測波長275 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL[6]。色譜圖如圖1～圖3所示。

圖1　β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品Fig.1　β,β-Dimethylacrylalkannin reference substance

圖2　京萬紅超臨界提取物Fig.2　SFE-CO2 extract of Jingwanhong

圖3　β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧陰性京萬紅超臨界提取物Fig.3　Blank control of β,β-dimethylacrylalkannin in SFE-CO2 extract of Jingwanhong

1.6.2供試品制備

向提取物中加300 mL無水乙醇，稱重，超聲溶解后至室溫稱重，補足失重，取5 mL于25 mL棕色容量瓶中，稱重，加乙腈定容至刻度，搖勻，用0.45 μm有機濾膜過濾，收集濾液。

1.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制6個不同濃度的β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧乙醇溶液，濃度分別為0.012 34、0.024 68、0.049 36、0.074 04、0.098 72和0.123 40 g/L，按1.6.1測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=2×107X+14 589，R2=0.999 6。

1.6.4精密度

取新配制0.254 40 g/Lβ，β-二甲基丙烯酰阿卡寧乙醇溶液，連續(xù)進樣5次，得RSD為1.95%。

1.6.5加樣回收率

精密量取同一超臨界提取物適量，共3份，分別加入1 g/Lβ,β-二甲基丙烯酰阿卡寧乙醇溶液制成供試品3份，按1.6.1測定含量，求得平均加樣回收率97.58%。

1.7　異歐前胡素的測定

1.7.1色譜條件

Kromasil C184.6×250 mm，流動相為乙腈-1%冰醋酸(50：50)，流速1.5 mL/min，檢測波長300 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。色譜圖如圖4～圖6所示。

圖4　異歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品Fig.4　Isoimperatorin reference substance

圖5　京萬紅超臨界提取物Fig.5　SFE-CO2 extract of Jingwanhong

圖6　異歐前胡素陰性京萬紅超臨界提取物Fig.6　Blank control of isoimperatorin in SFE-CO2 extract of Jingwanhong

1.7.2供試品制備

向提取物中加300 mL無水乙醇，稱重，超聲溶解后至室溫稱重、補足失重，取5 mL于25 mL棕色容量瓶中，稱重，加乙腈定容至刻度，搖勻，用0.45 μm有機濾膜過濾，收集續(xù)濾液。

1.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

新配制6個不同濃度異歐前胡素乙醇溶液分別為0.982 40、1.228 00、1.473 60、2.456 00、4.912 00和6.140 00 μg/mL，按1.7.1測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=13.36X-2.146 1，R2=0.999 8。

1.7.4精密度

新配制0.245 60 μg/mL異歐前胡素乙醇溶液，連續(xù)進樣5次，得RSD為1.05%。

1.7.5加樣回收率

精密量取同一超臨界提取物適量，共3份，分別加90 μg/mL異歐前胡素乙醇溶液，制成供試品3份，根據(jù)1.7.1中HPLC條件測定含量，求得加樣回收率96.61%。

2　結(jié)果與分析

2.1　均勻設(shè)計對提取工藝的優(yōu)化

以出膏率、β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧含量和異歐前胡素含量為指標(biāo)進行均勻設(shè)計。

均勻試驗結(jié)果見表1，各因素顯著性檢驗如表2，殘差分析如表3所示。

加權(quán)值=Σ實測值/均值×權(quán)數(shù)×100

其中出膏率的權(quán)數(shù)為0.5，β,β-二甲基丙烯酰阿卡寧的權(quán)數(shù)為0.25，異歐前胡素的權(quán)數(shù)為0.25。如第6組：

Y=(10.7/12.6×0.5+0.961/1.020×0.25+
69.58/84.85×0.25)×100

通過Excel軟件建立多元回歸模型[8]，采用多項式逐步回歸，獲得回歸方程：

第8組的預(yù)測Y值最大，殘差較小，表明壓力為25 MPa，溫度為50 ℃，醇濃度為95%時，收膏率及指標(biāo)成分含量各項指標(biāo)為最優(yōu)。

2.2　最適宜提取條件的驗證

采用壓力為25 MPa，溫度為50 ℃，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，重復(fù)3批進行驗證。結(jié)果如表4所示。

表均勻試驗設(shè)計與結(jié)果Table Uniform experimental design and results

表2　各因素顯著性檢驗Table 2　Significant inspection of various factors

表3　殘差分析Table 3　Residual analysis

表4　最適宜工藝驗證結(jié)果Table 4　Results of verifiction tests

結(jié)果顯示，通過均勻設(shè)計優(yōu)化超臨界提取京萬紅，所得最適宜工藝結(jié)果重復(fù)性良好。

3　結(jié)論

超臨界萃取法能夠有效保留京萬紅中熱敏有效成分，為京萬紅的二次開發(fā)提供了試驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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