與泛素-蛋白酶體代謝途徑有關(guān)的放射敏感性基因

楊 波綜述，謝叢華審校

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430070；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院放化療科，湖北 武漢 430071）

泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway)是細(xì)胞內(nèi)ATP依賴的非溶酶體蛋白降解系統(tǒng)[1]，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)修飾手段。它可以高效并高度選擇性地降解各種功能蛋白、癌基因產(chǎn)物等，還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象、細(xì)胞內(nèi)定位和多種酶活性，從而影響或調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)，包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞受體功能及腫瘤生長(zhǎng)、炎癥過(guò)程等，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。

1 泛素-蛋白酶體代謝途徑

泛素(Ubiquitin，Ub)是一個(gè)由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白，最早于1970年Avram Hershko在研究酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的ATP依賴性降解過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被命名為ATP依賴性蛋白酶解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），后來(lái)發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于各種真核生物體細(xì)胞內(nèi)而得名泛素。其分子量為8 kDa，結(jié)構(gòu)上高度保守，主要在蛋白降解、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)構(gòu)成和轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到中轉(zhuǎn)作用[2-3]。泛素在多個(gè)酶的作用下，通過(guò)一系列步驟與靶蛋白結(jié)合，即通過(guò)泛素羧基末端與靶蛋白中的賴氨酸形成共價(jià)結(jié)合的蛋白分子，而連接在靶蛋白上的泛素又可以被其他泛素繼續(xù)結(jié)合從而形成多聚泛素鏈，引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，被稱為“泛素化”。泛素化過(guò)程至少需要三種酶活化參與：泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。ATP使泛素C末端的腺苷酸活化，與E1酶半胱氨酸形成硫酯鍵，接著與E2酶形成另外的硫酯鍵中間產(chǎn)物，最后通過(guò)E3連接酶的幫助與底物蛋白結(jié)合[4]。有趣的是，不同的多聚泛素鏈具有不同的生理功能，與底物蛋白結(jié)合的lys48鏈和lys11鏈（Ub48和Ub11）可以將靶蛋白與26s蛋白酶體相結(jié)合，介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解[5]；而lys63鏈（Ub63）的連接則具有信號(hào)傳導(dǎo)功能，在DNA損傷的耐受，炎癥反應(yīng)，胞吞過(guò)程及核蛋白合成中發(fā)揮重要作用[6]。蛋白質(zhì)泛素化是一個(gè)可逆的過(guò)程，泛素可以在去泛素化酶家族（DUB）的作用下從其目標(biāo)底物上分離。

2 與泛素-蛋白酶體代謝途徑有關(guān)的放射敏感性基因

2.1 p53 p53是目前研究最多的腫瘤抑制基因和促凋亡基因，人類p53基因位于染色體17p13.l，包含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)16～20 kb，相對(duì)分子質(zhì)量為53 kDa，編碼393個(gè)氨基酸殘基。p53在正常細(xì)胞輻射后損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)細(xì)胞受到放射線照射引起DNA雙鏈或單鏈斷裂后，ATM基因激活，細(xì)胞內(nèi)p53濃度迅速上升，進(jìn)而激活p21基因和bax基因的表達(dá)，使細(xì)胞停止分裂進(jìn)行DNA修復(fù)，如修復(fù)失敗則使細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有超過(guò)50%的人類腫瘤存在p53基因突變。p53基因的導(dǎo)入可以高效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)，p53還與腫瘤細(xì)胞的放射敏感性密切相關(guān)。野生型p53基因可以增加腫瘤的放射治療敏感性，p53基因表達(dá)缺失或者突變則會(huì)引起放射抗拒。Shiomitsu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)D17骨肉瘤細(xì)胞野生型p53基因的表達(dá)，可以顯著提高其放射敏感性。Bohnke等[8]研究多種腫瘤細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，表達(dá)野生型p53基因的腫瘤細(xì)胞放射敏感性明顯高于表達(dá)突變型p53基因的細(xì)胞。Anwar等[9]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53水平較低與泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白降解有關(guān)。將MG132（泛素-蛋白酶體途徑抑制劑）加入體外培養(yǎng)的惡性黑色素瘤細(xì)胞中，可以檢測(cè)到p53表達(dá)上調(diào)，對(duì)照組中p53水平無(wú)明顯變化。進(jìn)一步研究提示MG132可以阻止p53的Ser-15和Ser-20磷酸化，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半壽期，提高穩(wěn)定性。鼠雙微粒體基因2（mdm2）是p53下游基因，同時(shí)Mdm2也作為E3連接酶使p53泛素化并且驅(qū)使p53降解,從而形成了負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在正常生理?xiàng)l件下,Mdm2抑制p53的表達(dá)[10]。

2.2 Chk1在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相中存在著檢測(cè)點(diǎn)(Check point)，它能識(shí)別細(xì)胞周期進(jìn)程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤，并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑制性因子，阻止細(xì)胞周期繼續(xù)運(yùn)行。當(dāng)DNA復(fù)制受到干擾或者DNA損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞周期的檢測(cè)點(diǎn)就被激活，使細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)DNA損傷，待細(xì)胞損傷修復(fù)后，細(xì)胞周期又恢復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)，此過(guò)程被稱為細(xì)胞周期的恢復(fù)，這一過(guò)程對(duì)于細(xì)胞維持細(xì)胞周期的節(jié)律性和保障DNA復(fù)制的保真性至關(guān)重要。細(xì)胞周期存在3個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，即G1，S期和G2/M期檢測(cè)點(diǎn)。馮建明等[11]報(bào)道：R16（新萘酰亞胺類化合物）可以促進(jìn)Chk1被泛素-蛋白酶體途徑降解，減少細(xì)胞內(nèi)Chk1蛋白的水平。使用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和Realtime-PCR兩種方法對(duì)HCT116細(xì)胞內(nèi)Chk1的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，R16處理HCT116細(xì)胞24 h后，Chk1的mRNA水平未見明顯變化，表明R16不是通過(guò)影響Chk1基因轉(zhuǎn)錄從而引起其蛋白水平的減少的。進(jìn)一步采用兩種特異性蛋白酶體抑制劑MG132和乳胞素分別與R16共處理HCT116細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，兩種抑制劑都能防止R16引起的Chk1蛋白減少。由于蛋白酶體依賴的降解與靶蛋白的泛素化密切相關(guān)，用MG132和R16共處理細(xì)胞后，用Chk1的抗體將細(xì)胞裂解液中的Chk1蛋白免疫沉淀，然后用泛素化抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在被蛋白酶體降解之前R16能夠促進(jìn)Chk1的泛素化。

2.3 Survivin Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis protein，IAPs）家族成員，它通過(guò)與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白，比如著絲粒中心蛋白（INCENP）等的相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活。Survivin還可以通過(guò)阻滯caspase依賴和非依賴的細(xì)胞凋亡途徑來(lái)抑制細(xì)胞死亡。因?yàn)榉暖?、化療等大多?shù)抗腫瘤治療都通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，Survivin的抗凋亡作用可以引起放化療等抗腫瘤治療的抵抗。Chakravarti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Survivin表達(dá)可以提高其放療敏感性。Rodel等[13]使用小干擾RNA轉(zhuǎn)染放療抗拒的SW480和HCT-15結(jié)直腸癌細(xì)胞株，24～48 h后Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減弱。在這期間給予放射線照射，細(xì)胞凋亡率會(huì)明顯增加，凋亡蛋白Caspase 3/7的相對(duì)活性在SW480細(xì)胞中由1.8增加至2.2，HCT-15細(xì)胞中由1.5增加至1.7。轉(zhuǎn)染Survivin小干擾RNA可以導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯，在放射線照射時(shí)DNA雙鏈斷裂增加。這些結(jié)果都提示了Survivin通過(guò)作用于細(xì)胞周期和DNA修復(fù)機(jī)制來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。在對(duì)59例結(jié)直腸癌患者的放化療效果隨訪中，高Survivin表達(dá)也和患者的腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后不良密切相關(guān)。梅柱中等[14]發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶抑制劑Lactacystin和MG132可以上調(diào)HeLa S3細(xì)胞中Survivin的表達(dá)，這表明HeLa S3細(xì)胞中Survivin蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。

2.4 Notch Notch信號(hào)通路在細(xì)胞分化、增殖過(guò)程中起重要作用，同時(shí)，也參與了血管生成的過(guò)程。Notch通路可以被缺氧和細(xì)胞因子（IL-1、IL-6）激活，與Hedgehog和Wnt通路一起影響下游靶基因的表達(dá)。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，Notch受體胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NICD）被裂解，并轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，引起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而NICD正是通過(guò)泛素化而降解。Notch信號(hào)通路在正常乳腺發(fā)育和乳腺癌的發(fā)生過(guò)程中都起重要作用。在體外，過(guò)表達(dá)Notch4可以阻滯乳腺上皮細(xì)胞的分化，在轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)高表達(dá)Notch4可以抑制乳腺細(xì)胞發(fā)育為分泌小葉，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺腫瘤[15]。這些都提示Notch表達(dá)的改變?cè)谌橄侔┑陌l(fā)展過(guò)程中起到十分重要的作用，除了Notch4以外，其他Notch受體和Notch配體也可以影響正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺腫瘤細(xì)胞的自我更新能力和分化，從而影響到腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。Phillips等[16]研究了電離輻射是否直接影響Notch-1信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)分次放射線處理激活Notch-1信號(hào)通路，將會(huì)引起乳腺癌干細(xì)胞的增加，從而在分次放射治療間隔提供了一個(gè)加速再增殖的機(jī)會(huì),引起放射抗拒。

2.5 Cyclin D1 Cyclin D1即細(xì)胞周期蛋白D1，其基因位于人染色體11q13區(qū)位，表達(dá)產(chǎn)物長(zhǎng)度為120 kb，由295個(gè)氨基酸構(gòu)成[17]。Cyclin D1與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase，CDK）中的Cdk4和Cdk6結(jié)合，形成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)磷酸化激酶。Rb磷酸化后，失去對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制活性，從而活化一系列基因，導(dǎo)致細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，啟動(dòng)DNA復(fù)制。在惡性淋巴瘤、甲狀腺腫瘤等很多人類腫瘤中都可以檢測(cè)到Cyclin D1基因的重組、擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)。在人工培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Cyclin D1，也可以檢測(cè)到G1期的明顯縮短。將Cyclin D1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株中以抑制Cyclin D1基因表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖表型。由于Cyclin D1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，也可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)放療不敏感，引起放療后腫瘤復(fù)發(fā)。Sundberg等[18]報(bào)道，地塞米松可以通過(guò)降低神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1的水平來(lái)阻滯細(xì)胞周期，但MG132可以逆轉(zhuǎn)地塞米松引起的Cyclin D1水平下降，這表明地塞米松可以促進(jìn)Cyclin D1經(jīng)過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解。

另外，許多細(xì)胞周期調(diào)控因子如p27[19]、p21、Cyclin A、Cyclin E等都是泛素-蛋白酶體途徑底物。由于這些影響DNA損傷后修復(fù)有關(guān)的基因所編碼的蛋白通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑代謝，那么基于泛素-蛋白酶體途徑來(lái)研究影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性可能是今后放射腫瘤學(xué)的研究方向之一。

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