與泛素-蛋白酶體代謝途徑有關(guān)的放射敏感性基因

楊 波綜述，謝叢華審校

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430070；2.武漢大學中南醫(yī)院放化療科，湖北 武漢 430071）

泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin proteasome pathway)是細胞內(nèi)ATP依賴的非溶酶體蛋白降解系統(tǒng)[1]，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)修飾手段。它可以高效并高度選擇性地降解各種功能蛋白、癌基因產(chǎn)物等，還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象、細胞內(nèi)定位和多種酶活性，從而影響或調(diào)節(jié)多種細胞活動，包括基因轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)節(jié)、免疫反應、細胞受體功能及腫瘤生長、炎癥過程等，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。

1 泛素-蛋白酶體代謝途徑

泛素(Ubiquitin，Ub)是一個由76個氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白，最早于1970年Avram Hershko在研究酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的ATP依賴性降解過程中被發(fā)現(xiàn)，當時被命名為ATP依賴性蛋白酶解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），后來發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于各種真核生物體細胞內(nèi)而得名泛素。其分子量為8 kDa，結(jié)構(gòu)上高度保守，主要在蛋白降解、膜轉(zhuǎn)運、染色質(zhì)構(gòu)成和轉(zhuǎn)錄、DNA修復和信號轉(zhuǎn)導起到中轉(zhuǎn)作用[2-3]。泛素在多個酶的作用下，通過一系列步驟與靶蛋白結(jié)合，即通過泛素羧基末端與靶蛋白中的賴氨酸形成共價結(jié)合的蛋白分子，而連接在靶蛋白上的泛素又可以被其他泛素繼續(xù)結(jié)合從而形成多聚泛素鏈，引起相應的生物學效應，被稱為“泛素化”。泛素化過程至少需要三種酶活化參與：泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。ATP使泛素C末端的腺苷酸活化，與E1酶半胱氨酸形成硫酯鍵，接著與E2酶形成另外的硫酯鍵中間產(chǎn)物，最后通過E3連接酶的幫助與底物蛋白結(jié)合[4]。有趣的是，不同的多聚泛素鏈具有不同的生理功能，與底物蛋白結(jié)合的lys48鏈和lys11鏈（Ub48和Ub11）可以將靶蛋白與26s蛋白酶體相結(jié)合，介導蛋白質(zhì)降解[5]；而lys63鏈（Ub63）的連接則具有信號傳導功能，在DNA損傷的耐受，炎癥反應，胞吞過程及核蛋白合成中發(fā)揮重要作用[6]。蛋白質(zhì)泛素化是一個可逆的過程，泛素可以在去泛素化酶家族（DUB）的作用下從其目標底物上分離。

2 與泛素-蛋白酶體代謝途徑有關(guān)的放射敏感性基因

2.1 p53 p53是目前研究最多的腫瘤抑制基因和促凋亡基因，人類p53基因位于染色體17p13.l，包含有11個外顯子和10個內(nèi)含子，長16～20 kb，相對分子質(zhì)量為53 kDa，編碼393個氨基酸殘基。p53在正常細胞輻射后損傷修復過程中發(fā)揮了重要作用，當細胞受到放射線照射引起DNA雙鏈或單鏈斷裂后，ATM基因激活，細胞內(nèi)p53濃度迅速上升，進而激活p21基因和bax基因的表達，使細胞停止分裂進行DNA修復，如修復失敗則使細胞進入程序性死亡。根據(jù)文獻報道，有超過50%的人類腫瘤存在p53基因突變。p53基因的導入可以高效的誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，同時，p53還與腫瘤細胞的放射敏感性密切相關(guān)。野生型p53基因可以增加腫瘤的放射治療敏感性，p53基因表達缺失或者突變則會引起放射抗拒。Shiomitsu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)D17骨肉瘤細胞野生型p53基因的表達，可以顯著提高其放射敏感性。Bohnke等[8]研究多種腫瘤細胞株發(fā)現(xiàn)，表達野生型p53基因的腫瘤細胞放射敏感性明顯高于表達突變型p53基因的細胞。Anwar等[9]報道，腫瘤細胞內(nèi)p53水平較低與泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白降解有關(guān)。將MG132（泛素-蛋白酶體途徑抑制劑）加入體外培養(yǎng)的惡性黑色素瘤細胞中，可以檢測到p53表達上調(diào)，對照組中p53水平無明顯變化。進一步研究提示MG132可以阻止p53的Ser-15和Ser-20磷酸化，延長其在體內(nèi)的半壽期，提高穩(wěn)定性。鼠雙微粒體基因2（mdm2）是p53下游基因，同時Mdm2也作為E3連接酶使p53泛素化并且驅(qū)使p53降解,從而形成了負反饋調(diào)節(jié)。在正常生理條件下,Mdm2抑制p53的表達[10]。

2.2 Chk1在細胞周期的各個時相中存在著檢測點(Check point)，它能識別細胞周期進程中出現(xiàn)的錯誤，并誘導細胞產(chǎn)生抑制性因子，阻止細胞周期繼續(xù)運行。當DNA復制受到干擾或者DNA損傷發(fā)生時，細胞周期的檢測點就被激活，使細胞有足夠的時間修復DNA損傷，待細胞損傷修復后，細胞周期又恢復運轉(zhuǎn)，此過程被稱為細胞周期的恢復，這一過程對于細胞維持細胞周期的節(jié)律性和保障DNA復制的保真性至關(guān)重要。細胞周期存在3個檢測點，即G1，S期和G2/M期檢測點。馮建明等[11]報道：R16（新萘酰亞胺類化合物）可以促進Chk1被泛素-蛋白酶體途徑降解，減少細胞內(nèi)Chk1蛋白的水平。使用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和Realtime-PCR兩種方法對HCT116細胞內(nèi)Chk1的mRNA水平進行檢測，結(jié)果顯示，R16處理HCT116細胞24 h后，Chk1的mRNA水平未見明顯變化，表明R16不是通過影響Chk1基因轉(zhuǎn)錄從而引起其蛋白水平的減少的。進一步采用兩種特異性蛋白酶體抑制劑MG132和乳胞素分別與R16共處理HCT116細胞24 h，結(jié)果顯示，兩種抑制劑都能防止R16引起的Chk1蛋白減少。由于蛋白酶體依賴的降解與靶蛋白的泛素化密切相關(guān)，用MG132和R16共處理細胞后，用Chk1的抗體將細胞裂解液中的Chk1蛋白免疫沉淀，然后用泛素化抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)在被蛋白酶體降解之前R16能夠促進Chk1的泛素化。

2.3 Survivin Survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitors of apoptosis protein，IAPs）家族成員，它通過與細胞周期相關(guān)的蛋白，比如著絲粒中心蛋白（INCENP）等的相互作用來促進細胞存活。Survivin還可以通過阻滯caspase依賴和非依賴的細胞凋亡途徑來抑制細胞死亡。因為放療、化療等大多數(shù)抗腫瘤治療都通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的生長，Survivin的抗凋亡作用可以引起放化療等抗腫瘤治療的抵抗。Chakravarti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的Survivin表達可以提高其放療敏感性。Rodel等[13]使用小干擾RNA轉(zhuǎn)染放療抗拒的SW480和HCT-15結(jié)直腸癌細胞株，24～48 h后Survivin mRNA和蛋白的表達明顯減弱。在這期間給予放射線照射，細胞凋亡率會明顯增加，凋亡蛋白Caspase 3/7的相對活性在SW480細胞中由1.8增加至2.2，HCT-15細胞中由1.5增加至1.7。轉(zhuǎn)染Survivin小干擾RNA可以導致細胞G2/M期阻滯，在放射線照射時DNA雙鏈斷裂增加。這些結(jié)果都提示了Survivin通過作用于細胞周期和DNA修復機制來影響腫瘤細胞的放療敏感性。在對59例結(jié)直腸癌患者的放化療效果隨訪中，高Survivin表達也和患者的腫瘤復發(fā)、預后不良密切相關(guān)。梅柱中等[14]發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶抑制劑Lactacystin和MG132可以上調(diào)HeLa S3細胞中Survivin的表達，這表明HeLa S3細胞中Survivin蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解。

2.4 Notch Notch信號通路在細胞分化、增殖過程中起重要作用，同時，也參與了血管生成的過程。Notch通路可以被缺氧和細胞因子（IL-1、IL-6）激活，與Hedgehog和Wnt通路一起影響下游靶基因的表達。當Notch受體與配體結(jié)合后，Notch受體胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NICD）被裂解，并轉(zhuǎn)運入細胞核，引起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而NICD正是通過泛素化而降解。Notch信號通路在正常乳腺發(fā)育和乳腺癌的發(fā)生過程中都起重要作用。在體外，過表達Notch4可以阻滯乳腺上皮細胞的分化，在轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)高表達Notch4可以抑制乳腺細胞發(fā)育為分泌小葉，進而導致乳腺腫瘤[15]。這些都提示Notch表達的改變在乳腺癌的發(fā)展過程中起到十分重要的作用，除了Notch4以外，其他Notch受體和Notch配體也可以影響正常乳腺上皮細胞和乳腺腫瘤細胞的自我更新能力和分化，從而影響到腫瘤細胞的放射敏感性。Phillips等[16]研究了電離輻射是否直接影響Notch-1信號通路,發(fā)現(xiàn)分次放射線處理激活Notch-1信號通路，將會引起乳腺癌干細胞的增加，從而在分次放射治療間隔提供了一個加速再增殖的機會,引起放射抗拒。

2.5 Cyclin D1 Cyclin D1即細胞周期蛋白D1，其基因位于人染色體11q13區(qū)位，表達產(chǎn)物長度為120 kb，由295個氨基酸構(gòu)成[17]。Cyclin D1與細胞周期依賴性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase，CDK）中的Cdk4和Cdk6結(jié)合，形成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)磷酸化激酶。Rb磷酸化后，失去對E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制活性，從而活化一系列基因，導致細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，啟動DNA復制。在惡性淋巴瘤、甲狀腺腫瘤等很多人類腫瘤中都可以檢測到Cyclin D1基因的重組、擴增和過表達。在人工培養(yǎng)的成纖維細胞中過表達Cyclin D1，也可以檢測到G1期的明顯縮短。將Cyclin D1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的腫瘤細胞株中以抑制Cyclin D1基因表達，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性增殖表型。由于Cyclin D1促進腫瘤細胞的惡性增殖，也可以導致腫瘤細胞對放療不敏感，引起放療后腫瘤復發(fā)。Sundberg等[18]報道，地塞米松可以通過降低神經(jīng)干細胞內(nèi)Cyclin D1的水平來阻滯細胞周期，但MG132可以逆轉(zhuǎn)地塞米松引起的Cyclin D1水平下降，這表明地塞米松可以促進Cyclin D1經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑降解。

另外，許多細胞周期調(diào)控因子如p27[19]、p21、Cyclin A、Cyclin E等都是泛素-蛋白酶體途徑底物。由于這些影響DNA損傷后修復有關(guān)的基因所編碼的蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑代謝，那么基于泛素-蛋白酶體途徑來研究影響腫瘤細胞放射敏感性可能是今后放射腫瘤學的研究方向之一。

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