環(huán)介導等溫擴增技術在疾控機構微生物檢測中的應用

唐海豐，熊鹿言，李 勇

（上海市普陀區(qū)疾病預防控制中心，上海 200333）

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種新型的體外核酸擴增技術[1]。該技術利用兩對特殊引物和有鏈置換活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶，使反應中在模板兩端引物結合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結構，在等溫條件下使引物順利與模板結合并進行鏈置換擴增反應。一般情況下，LAMP可以在60 min內擴增出109～1010倍靶序列拷貝，得到濃度高達500μg/ml的DNA。其擴增產物既可以通過常規(guī)的熒光定量和電泳檢測，也可以通過簡易的目測比色和焦磷酸鎂濁度檢測，還可以添加SYBR Green I、溴化乙錠（EB）或其他核酸染色劑進行顯色后觀察[2]。若在反應體系中加入逆轉錄酶，LAMP還可以實現(xiàn)對RNA模板的擴增（RT-LAMP）[3]。

LAMP技術由于其特異性強，敏感性高，操作簡便，產物易檢測，不需昂貴設備和特殊試劑就能特異、高效、快速、簡便地擴增靶序列等優(yōu)點，自問世后短短幾年已在各領域得到廣泛應用，目前國外已有較多的此類報道，并建立了專門的官方網站（http：//loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html）。LAMP在國內的應用雖然起步較晚，但專家學者已在畜牧業(yè)、植物檢疫、食品安全、醫(yī)學檢驗和傳染性疾病檢測等方面做了諸多研究，并不斷對LAMP技術進行改良使其更好地發(fā)揮作用[4-9]。本文就LAMP在疾病預防控制機構病原微生物檢測方面的應用作簡單綜述。

1 LAMP技術在疾病預防控制機構病原微生物檢測方面的應用

1.1 LAMP技術在呼吸道病毒檢測方面的應用 甲型H1N1流感的爆發(fā)對人類健康造成嚴重威脅，為更好地進行傳染病防控，減少不必要的憂慮和社會恐慌，快速特異的檢測出病原體至關重要。付文亮等[10]用RT-LAMP檢測甲型H1N1流感病毒核酸，并比較電泳、直接觀察、加入SYBR Green I核酸染料和優(yōu)化后的預染核酸染料的檢測靈敏度，結果顯示電泳檢測的靈敏度最高，加入SYBR Green I染料的靈敏度略低，而直接肉眼觀察靈敏度低約2個數(shù)量級。加入優(yōu)化后的預染染料其檢測靈敏度與加入SYBR Green I核酸染料相當。徐靈艷等[11]基于定性檢測甲型H1N1流感病毒的LAMP技術，研究出一種新系統(tǒng)，利用LAMP檢測過程中產生的副產物焦磷酸鎂沉淀導致檢測樣品池的濁度變化，而定性確定H1N1病毒分子是否存在。姜曉慧等[12]對H3亞型流感病毒設計兩對特征性引物和一個環(huán)引物，采用RT-LAMP技術檢測H3亞型流感病毒核酸，敏感度可達0.01TCID50/反應，與熒光定量RT-PCR的敏感度相一致，且對H1和H5亞型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、風疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒與腺病毒無交叉反應，具有良好的特異性。采用該方法檢測58份臨床標本，病毒分離的陽性率為37.9%，而熒光定量RT-PCR與RT-LAMP的陽性率分別為53.45%和51.72%，敏感度明顯高于通常的細胞病毒分離。李啟明等[13]建立了檢測H5N1禽流感病毒基因的RT-LAMP方法。使用特異對應于靶序列中8個基因區(qū)段的6條特異引物，在等溫條件下進行核酸擴增反應，對51份實驗感染動物及病毒培養(yǎng)標本的H5N1亞型禽流感病毒的HA、NA基因區(qū)進行了RT-LAMP檢測，并以SYBR Green I為反應指示劑進行了RT-LAMP，對該反應進行實時監(jiān)控，經對擴增產物做內切酶驗證和測序分析，證明了RT-LAMP技術的特異性；同時，用10倍系列稀釋的RNA樣品對該檢測方法的靈敏度進行了測試。結果顯示，利用RT-LAMP技術成功檢測到H5N1禽流感病毒的血凝素（HA）、NA基因區(qū)，且RT-LAMP與Real-time PCR結果呈現(xiàn)很好的一致性。此方法的靈敏度可達到能檢測10個拷貝RNA分子的水平。張坤等[14]針對H5N1禽流感病毒HA基因序列保守區(qū)域設計LAMP外引物、內引物和環(huán)引物，以克隆的陽性質粒為模板，對試驗中的幾個重要參數(shù)進行優(yōu)化。結果LAMP檢測方法對H5N1禽流感病毒的靈敏度達到4～6個拷貝，其引物對于H1、H9亞型禽流感病毒和新城疫病毒無非特異性擴增，表現(xiàn)出良好的H5亞型特異性。侯佳蕾等[15]根據(jù)美國國家生物信息中心（GenBank）上登錄的H5亞型禽流感病毒（H5-AIV）血凝素基因序列，設計了一套特異識別HA基因序列中6個不同區(qū)段的LAMP引物，并以此套引物建立了一種基于LAMP技術的H5亞型禽流感病毒診斷方法。實驗結果表明，該方法對H5-AIV RNA的最小檢測限為10-6，靈敏性高于一步RT-PCR方法，全部反應在1.5 h內完成；在反應體系中添加SYBR Green I染料后，可通過肉眼觀察有無熒光直接判定結果。靈敏性及特異性試驗證明，該方法靈敏度高，特異性好，能夠作為H5亞型禽流感病毒的快速診斷方法。彭宜等[16]針對H9亞型禽流感病毒AIV的HA基因序列，在保守區(qū)域設計了一套針對HA基因8個區(qū)域的6條特征性引物，并對反應條件進行優(yōu)化，建立了適用于H9亞型禽流感病毒AIV的RT-LAMP方法。結果表明，該方法對H3、H5、H7亞型AIV及其他禽呼吸道病原體均無擴增反應，并可通過反應液是否有沉淀或向反應液中加入熒光染料來對結果進行可視化觀察，且擴增反應只需在常規(guī)水浴鍋中進行，50 min之內即可完成反應。該方法對H9亞型AIV RNA的最小檢測限為0.01 pg，靈敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。蔣菲等[17]利用相似技術對H9亞型禽流感病毒AIVHA進行了RT-LAMP方法的建立，最低可檢測到103拷貝的目的基因重組質粒片段，較RT-PCR方法敏感10倍。通過對15種H亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒的檢測表明，該方法具有很好的特異性。在反應體系中使用鈣黃綠素與Mn2+的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結果判定，并且其判斷結果與濁度判斷結果一致。對109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進行檢測，RT-LAMP與RT-PCR檢出陽性樣本數(shù)分別為61份和46份，表明RT-LAMP方法的陽性檢出率高于RT-PCR。

1.2 LAMP技術在呼吸道細菌檢測方面的應用 嗜肺軍團菌于1976年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，主要通過污染建筑物中的水系傳播，易大規(guī)模暴發(fā)和流行。隨著經濟發(fā)展、中央空調的普遍使用，軍團菌爆發(fā)的危險性日益增加。由于軍團菌生長緩慢，普通培養(yǎng)檢測周期較長，血清免疫學方法靈敏度和特異性不高，因此其檢測存在一定的局限性。王水榮等[18]應用LAMP針對嗜肺軍團菌mip基因設計5條引物（2條內引物、2條外引物及1條環(huán)引物）對LAMP反應條件和反應體系進行優(yōu)化，并將該方法的特異性和敏感性與傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法及定量PCR方法比較。實驗結果表明，LAMP方法的檢出率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法及定量PCR，實驗建立的LAMP方法能夠快速、靈敏、特異地檢測嗜肺軍團菌。呂沁風等[19]運用LAMP設計一套引物特異性識別嗜肺軍團菌mip基因的6個特殊區(qū)域，在恒溫條件下，對8株嗜肺軍團菌和5株其他細菌進行檢測，并與普通PCR方法進行比對，驗證該方法的特異性和靈敏度。結果所有嗜肺軍團菌擴增產物均產生肉眼可見的白色沉淀，而其他不同菌株均不產生沉淀；加入熒光染料Smart green后，嗜肺軍團菌擴增產物均產生強綠熒光，其他菌株呈弱熒光。與普通PCR（檢出限約為57.6 pg）比，LAMP擴增反應的靈敏度大100倍左右，基因組DNA檢出限為576 fg，陽性水樣檢出限為8 CFU/ml。腦膜炎奈瑟菌（Nm）是流行性腦脊髓膜炎（流腦）的病原菌，人類是腦膜炎奈瑟菌唯一的易感宿主。李海清等[20]針對腦膜炎奈瑟菌屬（ctrA）基因序列的6個區(qū)域設計4條LAMP引物（2條內引物和2條外引物），同時設計2條環(huán)引物，并對反應條件進行優(yōu)化。分別驗證該方法的特異性及敏感性，并與普通PCR進行比較。實驗結果表明，在適宜反應條件所設計引物對腦膜炎奈瑟菌的擴增的特異性及敏感性均較好，與普通PCR方法比較，LAMP敏感性比普通PCR高10倍。周義正等[21]針對肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）R6株的lytA基因序列設計特異LAMP引物，以鹽酸胍-苯甲醇法提取陽性血培養(yǎng)瓶中細菌DNA，以LAMP技術擴增lytA基因，反應條件為63℃45 min，采用肉眼觀察濁度和瓊脂糖電泳的方法來觀察結果。結果在196份陽性血培養(yǎng)瓶中，采用LAMP法檢測到肺炎鏈球菌16株，與傳統(tǒng)的方法比較，其檢測肺炎鏈球菌的靈敏度和特異度均達到100%，模擬標本的檢測結果顯示該方法的最低檢測限為102CFU/ml。結核分枝桿菌的培養(yǎng)周期較長，不利于結核分枝桿菌的快速檢測。易海華等[22]根據(jù)結核分枝桿菌gyrB特征性序列設計的3對特征性引物對痰液中和培養(yǎng)基中的結核分枝桿菌進行檢測。其中1對環(huán)狀引物結合于特征性序列中環(huán)狀結構部分，可極大地加快LAMP反應速度，且不干擾內引物在LAMP反應中作用。實驗結果表明，使用環(huán)狀引物的LAMP反應可在0.5 h內完成，總共分析時間不超過1 h。LAMP檢測技術的靈敏度比經典PCR技術高100倍左右，具有與實時PCR（Real-time PCR）技術相同的特異度。

1.3 LAMP技術在食源性致病菌檢測方面的應用 食品安全是近年社會關注的一個焦點。食源性疾病與食品污染構成了一個巨大并不斷擴大的公共衛(wèi)生問題。自2002年起，我國建立了國家食源性病原菌監(jiān)測網絡，為食品安全和風險評估提供科學依據(jù)。在食品污染所引發(fā)的腸道疾病中，不耐熱型產腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）是引起食物中毒的常見腸道致病菌之一。羅海等[23]選用不耐熱腸毒素（LT）編碼基因的6個保守區(qū)設計LAMP引物，優(yōu)化dNTPs濃度、Bst DNA聚合酶濃度、反應溫度、反應時間等反應條件，評估該方法的特異性和靈敏性。結果顯示，該方法檢測不耐熱型產腸毒素大腸桿菌時間短，特異性較好，靈敏度高。沙門菌屬是引起細菌性食物中毒的重要病原體之一，也是腸桿菌科中最復雜的菌屬。2003-2005年食源性疾病監(jiān)測網的數(shù)據(jù)顯示沙門菌占微生物食源性疾病的17.19%，排在第2位[24]。歐新華等[25]針對沙門菌屬侵襲蛋白（invA）基因序列的6個區(qū)域設計4條LAMP引物，65℃保溫約60 min完成對沙門菌屬的擴增。利用LAMP和普通PCR方法同時檢測4株沙門菌和9株非沙門菌（對照組）來驗證該方法的特異性，將腸炎沙門菌菌液做一系列10倍稀釋后用LAMP和PCR方法進行檢測，比較兩者敏感性。4株沙門菌擴增出LAMP特征性梯狀條帶，9株非沙門菌未出現(xiàn)LAMP擴增，產物的特異性通過限制性內切酶得到證實。LAMP檢測沙門菌屬的特異性與普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP檢測沙門菌屬的檢測下限為10 CFU/ml，PCR檢測下限為100 CFU/ml。LAMP檢測速度相比PCR更快速，在60 min內即可完成擴增反應。朱勝梅等[26]根據(jù)沙門菌特異性invA基因設計引物進行LAMP，同時優(yōu)化反應條件，建立了沙門菌LAMP快速檢測技術。實驗結果表明，LAMP的最佳反應條件為外引物濃度5 pmol/L、內引物濃度為40 pmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTP濃度為0.8 mmol/L，甜菜堿濃度0.8 mmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，反應溫度63℃，反應時間1 h，在此條件下LAMP檢測到沙門菌DNA的敏感度達10 fg時反應，且與其他常見的細菌無交叉反應，對牛奶樣品的檢出量為102CFU/ml。易海華等[27]針對志賀菌侵襲性質?？乖璈基因（ipaH）特征性保守序列設計1套4條引物，應用LAMP技術對21株志賀菌和非志賀菌進行特異性檢測以確定其特異性；使用LAMP和聚合酶鏈式反應對ipaH基因重組質粒倍比稀釋液進行檢測以確定其靈敏度；使用重組質粒計算其初始拷貝數(shù)與反應時間之間的線性關系以評估定量檢測的可能性。實驗結果表明，LAMP技術可以在1 h內獲得結果；有較好的特異性，與其他17種食源性致病菌無交叉反應；LAMP檢測技術的靈敏度高出經典PCR技術10倍以上，檢測限達到200拷貝/μl，平均變異系數(shù)＜5%；反應時間與模板初始濃度有良好的線性關系（r2=0.9855）。徐芊等[28]針對副溶血性弧菌不耐熱溶血素基因（tdh）設計4條特異性引物（兩條內引物和兩條外引物）進行LAMP擴增，對擴增反應進行優(yōu)化，最佳反應時間為60 min，反應溫度為60℃。對12種細菌共28株菌進行LAMP擴增，僅副溶血性弧菌得到陽性擴增結果，證明引物具有很高的特異性。副溶血性弧菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的檢測靈敏度分別為90 fg和24 CFU/ml。對模擬食品樣品進行檢測，檢測限為89 CFU/g，整個實驗過程1 h即可完成。易海華等[29]針對金黃色葡萄球菌clfA基因保守序列，根據(jù)LAMP方法的原理，設計LAMP反應體系和程序，對方法的特異性、靈敏度、重復性及初始拷貝數(shù)的對數(shù)值與反應時間（熒光信號值為1×104時對應的時間）之間的線性關系進行評估。結果使用LAMP方法可以在0.5 h內獲得檢測結果，LAMP檢測技術的靈敏度高出經典PCR技術10倍以上，與其他相關致病菌無交叉反應，平均試驗間變異系數(shù)小于5%，反應時間與模板濃度有良好的線性關系（r2=0.9501），LAMP法檢測臨床樣本中金黃葡萄球菌的靈敏度為100%，特異度為94.4%，符合性為96.6%。申建維等[30]利用包被有SPA單克隆抗體的磁珠富集樣品中的金黃色葡萄球菌，快速提取其DNA，用LAMP擴增金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA,擴增條件為65℃保溫1 h。在反應過程中，熒光探針與mecA基因的擴增產物互補序列結合，產生熒光，通過檢測反應管中的熒光值來判定結果。實驗結果顯示，該方法的最低檢測限為10 CFU/ml，與M-H培養(yǎng)基苯唑西林藥敏試驗結果相比較，靈敏性為99%，特異性為90.9%；與PCR方法比較，敏感性為100%，特異性為100%；實驗時間縮短1 h。齊哲等[31]針對蠟樣芽胞桿菌的溶血素基因hblA設計引物，將FTA濾膜提取DNA與LAMP法相結合，檢測蠟樣芽胞桿菌和人工污染蠟樣芽胞桿菌的消毒乳。結果表明，LAMP對抽提的DNA最低檢出濃度為4.4 CFU/ml，比PCR檢測靈敏度高10倍。人工污染消毒乳中蠟樣芽胞桿菌的檢出限為57 CFU/ml。LAMP擴增最短可在20 min內完成，對消毒乳中蠟樣芽胞桿菌的整個檢測（包括DNA提取、LAMP和電泳）可在2 h內完成?？漳c彎曲菌是世界上公認的引起急性腹瀉和腸胃炎的主要病原菌。林超等[32]以空腸彎曲菌的促旋酶基因A（gyrA）設計引物建立空腸彎曲菌的LAMP快速檢測方法。實驗結果表明，設計的引物具有良好的特異性，與細菌平板計數(shù)和PCR法的靈敏度比較，LAMP檢測與PCR法有相近的靈敏度，比細菌平板計數(shù)法靈敏度高3個數(shù)量級。研究結果還表明，提取核酸前加入DNase可以有效地減少死菌DNA對LAMP結果的影響。單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種能夠引起人獸共患疾病的食源性致病菌，WHO已將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一，主要能引起人與動物的腦炎、菌血癥、流產、無敗血癥性單核細胞增多癥等，尤其是免疫力低下者、嬰幼兒、老年人、孕婦等易受感染而發(fā)病。唐夢君等[33]根據(jù)LM hlyA基因序列中的保守區(qū)域進行LAMP擴增，并與常規(guī)PCR方法進行比較，結果建立的LAMP方法能成功擴增出梯形條帶，LAMP檢測單核細胞增生李斯特菌純培養(yǎng)物和人工染菌的靈敏度為5.44×102CFU/ml，而對照PCR檢測的靈敏度為5.44×104CFU/ml，對10株細菌進行LAMP擴增，僅單核細胞增生李斯特菌得到陽性結果，從DNA提取到報告結果耗時僅1 h。張體銀等[34]同樣針對單增李斯特菌hly基因保守區(qū)域設計特異引物進行DNA等溫擴增。3株單增李斯特菌均擴增出特異性目的片段，而10株非單增李斯特菌均未產生目的片段，特異性為100%，無假陽性和假陰性出現(xiàn)。用LAMP在65℃條件下1 h內即可檢出單增李斯特菌，靈敏度達100 CFU/ml。用該方法與國標方法分別檢測50種樣品中的單增李斯特菌，兩種方法的符合率達到100%。魯曦等[35]針對阪崎腸桿菌16s RNA基因設計4條引物特異性識別靶基因的六個特殊區(qū)域，建立了一套嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌快速檢測的LAMP方法。該方法能夠在5 h內檢測出復原乳樣品中101 CFU/ml的阪崎腸桿菌，檢測阪崎腸桿菌基因組DNA的靈敏度為100 fg，不僅能夠用于嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌的檢測，而且滿足了對嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌快速檢測的迫切需要。朱水榮等[36]針對EHEC O157：H7的O157抗原編碼rfbE、志賀樣毒素stx2、H7鞭毛抗原編碼fliC基因分別設計引物，并對LAMP反應條件和反應體系進行優(yōu)化。對2株背景明確的實驗對照菌EHEC O157：H7標準菌株、17株O157地方分離株、33株非O157其他腸道菌株進行檢測，并與PCR結果比較，驗證該方法的特異性、敏感性。結果顯示具有相應靶基因的O157菌株經LAMP的檢測結果均與PCR法相同，呈綠色且電泳有相應條帶為陽性，非O157其他腸道菌株均檢測呈橙色并電泳無相應條帶為陰性。反應體系檢測限為26 CFU/ml，且結果在白光下通過肉眼即可判斷。朱海等[37]選取E.coli O157：H7的rfbE基因設計LAMP引物，優(yōu)化建立LAMP檢測體系。并用該體系和國標法對76份人工污染樣品進行檢測。結果所建立的E.coli O157：H7 LAMP體系具有良好的特異性，用該體系對9屬13種41株菌進行檢測，結果只有E.coli O157：H7的擴增產物電泳結果為階梯狀條帶，非E.coli O157：H7均未產生擴增引物，靈敏性為27 CFU/ml。樣品及培養(yǎng)基對反應體系無影響或影響很小。對76份樣品進行了檢測，E.coli O157：H7 LAMP檢測方法與國標法的總符合率為96.1%，2 h內即可完成檢測。徐義剛等[38]基于EHEC O157：H7保守的rfbE基因序列，設計4條引物，成功建立了EHEC O157：H7 LAMP快速檢測方法，60 min內即可完成致病菌檢測。利用該方法對30種共38株細菌進行檢測，所試EHEC O157：H7均為陽性結果，說明該方法具有高度的特異性。該方法對純培養(yǎng)的EHEC O157：H7檢出限為12 CFU/ml，污染食品中EHEC O157：H7的檢出限為18 CFU/g。實踐應用表明，對1 121份進出口肉類、奶類制品及人工污染樣品進行檢測，檢出57份LAMP陽性，與采用AOAC標準檢測結果的符合率為100%?；魜y是由霍亂弧菌引起的，以腹瀉為主要癥狀的烈性傳染病，在我國屬于甲類傳染病。朱水榮等[39]應用LAMP針對O139霍亂弧菌wbfR基因設計4條引物（2條內引物和2條外引物），優(yōu)化LAMP反應條件和反應體系，并對13株種系背景明確的霍亂弧菌不同實驗對照株、30株O139群霍亂弧菌地方分離株、10株O1群霍亂弧菌地方分離株、32株其他腸道菌進行檢測，驗證該方法的特異性，通過肉眼目測或電泳檢測比較結果。結果所有O139群霍亂弧菌經LAMP檢測均呈綠色電泳有階梯狀條帶為陽性，O1群霍亂弧菌及其他腸道菌均檢測呈橙色并電泳無相應條帶為陰性；該體系最低檢測限為63 CFU/ml。該研究建立的LAMP方法能夠快速、靈敏、特異地檢測O139群霍亂弧菌，無需昂貴的儀器，簡單方便，非常適合基層檢驗部門或小型實驗室以及流行病學人員于應急車上或現(xiàn)場監(jiān)測等使用，值得推廣。嗜水氣單胞菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株對水產動物、家畜和人均有致病作用，在動物疾病學和食品衛(wèi)生學研究上都具有重要意義。程天印等[40]基于嗜水氣單胞菌氣溶素基因的序列，設計了一套引物，通過條件優(yōu)化，成功建立了針對致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測法。結果表明該法只檢出致病性嗜水氣單胞菌，對不同濃度的細菌懸液擴增結果表明LAMP檢測嗜水氣單胞菌的最低菌液濃度為1.4～14 CFU/μl，高于普通PCR方法。

1.4 LAMP技術在腸道病毒檢測方面的應用 諾如病毒是繼輪狀病毒后引起非細菌性急性腸胃炎的主要病原之一，常通過糞口途徑傳播。陳宗峰等[41]采用RT-LAMP擴增諾如病毒特異性基因，并與RT-PCR方法比較。結果RT-LAMP法更加簡便快速、特異性好、具有更高的靈敏度、不需要復雜儀器設備等優(yōu)點，為臨床檢測諾如病毒快速簡便的新方法。手足口?。℉and foot and mouth disease，HFMD）自1957年首次報告以來，世界各地不斷出現(xiàn)新疫情，其流行呈明顯上升趨勢。HFMD可由多種病毒引起，其中腸道病毒71型（EV71）是導致HFMD最重要的病原體。耿英芝等[42]針對EV71 VP1基因的8個區(qū)域設計6條特異性引物，建立檢測該靶序列的RT-LAMP方法，對其特異性和敏感性進行了驗證，并對手足口病患者標本進行檢測，并與RT-PCR及Real-time PCR方法進行了比較。實驗結果表明，利用RT-LAMP方法能成功檢測到EV71 VP1基因區(qū)，等溫條件下60 min內即可完成檢測，該方法簡便快捷、敏感性高、特異性好，其陽性率高于RT-PCR方法（P＜0.05），與Real-time PCR結果呈現(xiàn)良好的一致性（P＞0.05），適用于EV71感染的快速檢測及分子流行病學的監(jiān)測，具有很好的開發(fā)應用前景。

1.5 LAMP技術在寄生蟲檢測方面的應用 弓形蟲是一種嚴重危害人類及家畜的機會性致病原蟲，呈世界級分布，可侵犯除成熟紅細胞以外的任何有核細胞，引起多種組織、器官病變和損害。李月梅等[43]研究建立了弓形蟲快速檢測的LAMP方法。用10倍系列稀釋的DNA樣品對該檢測方法的靈敏度進行了測試，此方法的靈敏度可達到能檢測5個拷貝DNA分子水平，擴增產物內切酶驗證結果正確；成功檢測到弓形蟲基因區(qū)，對新孢子蟲、附紅細胞體、瑟氏泰勒蟲等病原體檢測均為陰性，顯示出較強的特異性。楊秋林等[44]用酚-氯仿法提取弓形蟲速殖子基因組DNA，設計兩對擴增弓形蟲B1基因的LAMP引物。以間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卡氏肺孢子蟲、日本血吸蟲及小鼠白細胞做對照進行LAMP反應，產物經SYBR GreenⅠ顯色及電泳后觀察結果，將弓形蟲速殖子經倍比稀釋為（2～3）×106個/ml等8個濃度進行LAMP反應驗證該方法的敏感性。實驗結果顯示，弓形蟲速殖子檢測管經顯色后呈綠色為陽性，LAMP產物經電泳后呈特征性梯狀條帶，對照組均無擴增產物。LAMP技術可檢測到的弓形蟲速殖子最低濃度為2～3個/ml。尾蚴是日本血吸蟲的感染期，檢測水體尾蚴的有無，可為安全用水、預防人畜感染提供依據(jù)，現(xiàn)用的尾蚴檢測方法操作較繁瑣。楊秋林等[45]使用基因釋放劑快速提取尾蚴基因組DNA，設計4條擴增尾蚴鈣結合蛋白基因的LAMP，以華支睪吸蟲為陰性對照進行LAMP反應，產物經顯色、電泳鑒定。用細吸管在解剖鏡下分別吸取20條、10條、5條、1條尾蚴進行LAMP反應檢測其敏感性。結果尾蚴檢測管經顯色后呈綠色（陽性），對照組呈棕色（陰性），產物經電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，對照組無擴增產物，LAMP可檢測到尾蚴的最低數(shù)量為1條。間日瘧原蟲（Plasmodium vivax，P.V）是間日瘧的病原體。瘧疾的傳統(tǒng)檢查方法是血膜涂片經染色后鏡檢，該法簡便、成本低，但費時、費力且容易漏診。楊秋林等[46]用酚-氯仿法提取P.V基因組DNA，設計4條擴增P.V環(huán)子孢子蛋白基因的LAMP引物，以惡性瘧原蟲、弓形蟲、人全血DNA為對照進行LAMP反應，產物經顯色、電泳鑒定。將P.V血樣用健康人血做1.5×10-3～1.5×10-86個濃度后進行LAMP檢測其敏感性。結果P.V LAMP擴增產物檢測管顯色后呈陽性，對照組均為陰性。產物電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，對照組均無擴增條帶。LAMP檢測P.V的敏感度為1.5個瘧原蟲/107RBC?？ㄊ戏捂咦酉x（Pneumocystis carinii，Pc）寄生于哺乳動物肺部，引起卡氏肺孢子蟲肺炎（PCP），由于PCP的病原學檢查困難，健康人群抗體陽性率高達50%～60%，故檢測抗體也不適于PCP的診斷。楊秋林等[47]用醋酸可的松經皮下注射Wistar大鼠誘導Pc基因，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）提取Pc基因組DNA。設計4條擴增Pc線粒體核糖體大亞基（mtrRNA）基因的LAMP引物，以結核桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、弓形蟲、大鼠白細胞為對照，進行LAMP反應。LAMP產物經顯色、電泳及酶切鑒定。將Pc DNA稀釋10倍后同時進行LAMP和PCR，比較其敏感性。結果Pc檢測管經顯色后呈綠色（陽性），對照組均呈棕色（陰性）。Pc LAMP產物經電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，擴增產物經Tail限制性內切酶酶切鑒定正確，對照組均無擴增產物。LAMP可檢測到蟲體DNA的最低濃度是1 pg/μl，為PCR的10倍。

2 結 語

LAMP方法是本世紀發(fā)展起來的一種分子生物學技術，雖然還存在著諸多的缺點和不足，但其在多個領域表現(xiàn)出來的特異性高、敏感性好、便捷快速等優(yōu)點使其在疾病預防控制機構微生物檢測方面的應用顯示出了令人鼓舞的前景。該方法不需昂貴的PCR儀和特殊檢測試劑，尤其適合在基層檢測機構微生物實驗室的推廣和應用。

LAMP技術雖然原理復雜，特別是引物的設計相當專業(yè)，其難點主要在于如何從200～300個堿基的靶序列中設計4條符合要求的引物。但這些都可以由專業(yè)的研究單位和試劑公司來完成，對檢測人員而言其操作卻是十分方便。若開發(fā)研究相應的檢測試劑盒，必然會有巨大的市場前景，該技術也有望成為簡易的常規(guī)檢測手段。

隨著LAMP技術的不斷研究和改進，其在微生物檢測領域將發(fā)揮更加重要的作用。堅信隨著技術的不斷完善，該方法作為分子生物學的一種快速檢測技術必將廣泛應用于各種病原體的快速檢測和疾病的快速診斷，為及時控制傳染病疫情和應對公共衛(wèi)生突發(fā)事件提供強有力的技術支撐。

[1]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].NucleicAcids Res,2000,28(12)：63.

[2]Yasuyoshi M,Nagamine K,Tmita N,et al.Tection of Loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Bioch and Bioph Res Com,2001,289：150-154.

[3]Soliman H,El-Matbouli M.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus(VHS)[J].Vet Microbiol,2006,114(3-4)：205-213.

[4]彭永剛,孫恩成,劉 飛,等.環(huán)介導等溫擴增技術在畜牧獸醫(yī)領域的應用[J].中國獸醫(yī)科學,2010,40（5）：543-546.

[5]楊雷亮,邱德義,管 維,等.核酸環(huán)介導等溫擴增技術及其在植物檢疫中的作用[J].植物檢疫,2009,23（4）：42-44.

[6]江迎鴻,劉 垚,譚貴良,等.LAMP技術及其在食品安全檢測中的應用[J].廣東農業(yè)科學,2010,7：220-222.

[7]申振華,陳文明,李愛華,等.LAMP技術在醫(yī)學檢驗中的應用[J].醫(yī)學檢驗與臨床,2010,21（4）：97-98.

[8]蔡哲鈞,馮杰雄.環(huán)介導等溫擴增技術及在傳染性疾病檢測中的應用[J].國際流行病學傳染病學雜志,2006,33（5）：343-358.

[9]劉寶山,潘樹德,陳 博,等.環(huán)介導等溫擴增技術的改進和發(fā)展[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41（7）：98-101.

[10]付文亮,蔡 欣,查 磊,等.RT-LAMP檢測甲型H1N1病毒核酸幾種結果判定方法[J].醫(yī)學研究雜志,2010,39（5）：68-70.

[11]徐靈艷,李富勇,吳青青,等.基于核酸環(huán)介導等溫擴增的甲型H1N1流感檢測系統(tǒng)設計[C].中國儀器儀表學會,2010年全國科學儀器自主創(chuàng)新及應用技術研討會論文,武漢,2010.

[12]姜曉慧,陳 寅,盧亦愚,等.甲3型流行性感冒病毒環(huán)介導逆轉錄等溫擴增檢測方法的建立與應用[J].中國疫苗和免疫,2008,14（3）：242-245.

[13]李啟明,馬學軍,高寒春,等.逆轉錄環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）在H5N1禽流感病毒基因檢測中的應用[J].病毒學報,2008,24（3）：178-184.

[14]張 坤,黃 偉,李 剛.H5N1禽流感病毒環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立[J].生物技術通訊,2009,20（2）：217-220.

[15]侯佳蕾,羅開健,樊惠英,等.H5亞型禽流感病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學,2008,38（12）：1070-1074.

[16]彭 宜,謝芝勛,劉加波,等.H9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學報,2011,27（1）：19-28.

[17]蔣 菲,黃書林,徐 威,等.H9亞型禽流感病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立與熒光指示劑的應用[J].農業(yè)生物技術學報,2011,19（1）：191-196.

[18]王水榮,王志剛,張 政,等.嗜肺軍團菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立與應用[J].中華流行病學雜志,2009,30（5）：481-485.

[19]呂沁風,鄭 偉,羅 鵬,等.嗜肺軍團菌環(huán)介導等溫擴增檢測法的建立[J].浙江大學學報（醫(yī)學版）,2010,39（3）：305-310.

[20]李海清,邵祝軍,朱兵清,等.環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測腦膜炎奈瑟菌屬方法的建立[J].疾病監(jiān)測,2010,25（5）：397-400.

[21]周義正,陳 麗,李紅海,等.環(huán)介導等溫擴增檢測肺炎鏈球菌方法的建立及臨床應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2008,31（5）：562-565.

[22]易海華,丁永健,錢志娟,等.環(huán)介導等溫擴增技術檢測痰標本中結核分支桿菌的研究[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2008,31（1）：7-17.

[23]羅 海,鄭春亮,萬紅梅,等.環(huán)介導等溫擴增法快速檢測產腸毒素大腸桿菌的研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31（7）：127-130.

[24]樊永祥.食源性疾病控制與餐飲食品安全管理[J].國外醫(yī)學（衛(wèi)生學分冊）,2006,33（3）：170-175.

[25]歐新華,張如勝,宋克云,等.環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術檢測沙門菌屬方法的建立[J].實用預防醫(yī)學,2008,15（6）：1945-1947.

[26]朱勝梅,吳佳佳,徐 馳,等.環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測沙門菌[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24（7）：725-730.

[27]易海華,趙金偉,房 超,等.志賀菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J].中國公共衛(wèi)生,2011,27（3）：380-382.

[28]徐 芊,孫曉紅,趙 勇,等.副溶血弧菌LAMP檢測方法的建立[J].中國生物工程雜志,2007,27（12）：66-72.

[29]易海華,何廣會,房 超,等.使用環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測金黃葡萄球菌的初步研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2010,30（4）：382-386.

[30]申建維,王 旭,范春明,等.等溫擴增檢測耐藥基因mecA方法的建立及其臨床應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2006,29（2）：114-116.

[31]齊 哲,張 偉,劉衛(wèi)華,等.FTA濾膜與環(huán)介導等溫擴增技術結合快速檢測消毒乳中的蠟樣芽胞桿菌[J].中國食品學報,2009,9（3）：156-161.

[32]林 超,梁成珠,徐 彪,等.空腸彎曲菌LAMP快速檢測方法的建立[J].微生物學通報,2009,36（6）：923-928.

[33]唐夢君,高玉時,周 生,等.應用環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測單核細胞增生李斯特菌的研究[J].中國動物檢疫,2010,27（9）：25-28.

[34]張體銀,鄭 晶,黃曉蓉,等.環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測食品中的單增李斯特氏菌[J].中國食品學報,2010,10（3）：200-204.

[35]魯 曦,師寶忠,王 彬,等.LAMP法檢測乳粉中的阪崎腸桿菌[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26（5）：540-543.

[36]朱水榮,陳 寅,王志剛,等.環(huán)介導等溫擴增法應用于腸出血性大腸埃希氏菌O157：H7的檢測[J].中華預防醫(yī)學雜志,2009,43（9）：803-808.

[37]朱 海,呂敬章,范 放,等.E.coli O157：H7 LAMP檢測方法的建立[J].分子診斷與治療雜志,2010,2（2）：98-101.

[38]徐義剛,崔麗春,李蘇龍,等.腸出血性大腸埃希氏菌O157：H7環(huán)介導恒溫擴增快速檢測方法的建立與應用[J].中國人獸共患病雜志,2010,26（7）：618-623.

[39]朱水榮,陳 寅,王志剛,等.應用環(huán)介導等溫擴增法快速檢測O139群霍亂弧菌[J].中華微生物學和免疫學雜志,2009,29（6）：564-567.

[40]程天印,劉 洵,常小斌.嗜水氣單胞菌LAMP檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)科學,2007,37（12）：1013-1016.

[41]陳宗峰,王 滔,黃祖新,等.逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術在諾如病毒基因檢測中的應用[J].中國人獸共患病學報,2009,25（4）：340-343.

[42]耿英芝,姚文清,郭軍巧,等.檢測腸道病毒71型RT-LAMP技術的建立及其應用[J].中國人獸共患病學報,2011,27（3）：176-179.

[43]李月梅,薛書江,其木格,等.弓形蟲環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41（11）：30-32.

[44]楊秋林,張如勝,伍和平,等.應用環(huán)介導等溫擴增技術檢測弓形蟲[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2008,26（4）：304-306.

[45]楊秋林,許麗芳,張愉快,等.環(huán)介導等溫擴增技術檢測日本血吸蟲尾蚴的實驗研究[J].中國血吸蟲病防治雜志,2008,20（3）：209-211.

[46]楊秋林,許麗芳,張愉快,等.環(huán)介導等溫擴增技術檢測間日瘧原蟲的研究[J].中國病原生物學雜志,2008,3（8）：593-597.

[47]楊秋林,張如勝,伍和平,等.環(huán)介導等溫擴增技術檢測卡氏肺孢子蟲的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2008,28（6）：565-567.