環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在疾控機(jī)構(gòu)微生物檢測中的應(yīng)用

唐海豐，熊鹿言，李 勇

（上海市普陀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200333）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)[1]。該技術(shù)利用兩對特殊引物和有鏈置換活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶，使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在等溫條件下使引物順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。一般情況下，LAMP可以在60 min內(nèi)擴(kuò)增出109～1010倍靶序列拷貝，得到濃度高達(dá)500μg/ml的DNA。其擴(kuò)增產(chǎn)物既可以通過常規(guī)的熒光定量和電泳檢測，也可以通過簡易的目測比色和焦磷酸鎂濁度檢測，還可以添加SYBR Green I、溴化乙錠（EB）或其他核酸染色劑進(jìn)行顯色后觀察[2]。若在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，LAMP還可以實(shí)現(xiàn)對RNA模板的擴(kuò)增（RT-LAMP）[3]。

LAMP技術(shù)由于其特異性強(qiáng)，敏感性高，操作簡便，產(chǎn)物易檢測，不需昂貴設(shè)備和特殊試劑就能特異、高效、快速、簡便地?cái)U(kuò)增靶序列等優(yōu)點(diǎn)，自問世后短短幾年已在各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，目前國外已有較多的此類報(bào)道，并建立了專門的官方網(wǎng)站（http：//loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html）。LAMP在國內(nèi)的應(yīng)用雖然起步較晚，但專家學(xué)者已在畜牧業(yè)、植物檢疫、食品安全、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和傳染性疾病檢測等方面做了諸多研究，并不斷對LAMP技術(shù)進(jìn)行改良使其更好地發(fā)揮作用[4-9]。本文就LAMP在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物檢測方面的應(yīng)用作簡單綜述。

1 LAMP技術(shù)在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)病原微生物檢測方面的應(yīng)用

1.1 LAMP技術(shù)在呼吸道病毒檢測方面的應(yīng)用 甲型H1N1流感的爆發(fā)對人類健康造成嚴(yán)重威脅，為更好地進(jìn)行傳染病防控，減少不必要的憂慮和社會(huì)恐慌，快速特異的檢測出病原體至關(guān)重要。付文亮等[10]用RT-LAMP檢測甲型H1N1流感病毒核酸，并比較電泳、直接觀察、加入SYBR Green I核酸染料和優(yōu)化后的預(yù)染核酸染料的檢測靈敏度，結(jié)果顯示電泳檢測的靈敏度最高，加入SYBR Green I染料的靈敏度略低，而直接肉眼觀察靈敏度低約2個(gè)數(shù)量級。加入優(yōu)化后的預(yù)染染料其檢測靈敏度與加入SYBR Green I核酸染料相當(dāng)。徐靈艷等[11]基于定性檢測甲型H1N1流感病毒的LAMP技術(shù)，研究出一種新系統(tǒng)，利用LAMP檢測過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀導(dǎo)致檢測樣品池的濁度變化，而定性確定H1N1病毒分子是否存在。姜曉慧等[12]對H3亞型流感病毒設(shè)計(jì)兩對特征性引物和一個(gè)環(huán)引物，采用RT-LAMP技術(shù)檢測H3亞型流感病毒核酸，敏感度可達(dá)0.01TCID50/反應(yīng)，與熒光定量RT-PCR的敏感度相一致，且對H1和H5亞型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒與腺病毒無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。采用該方法檢測58份臨床標(biāo)本，病毒分離的陽性率為37.9%，而熒光定量RT-PCR與RT-LAMP的陽性率分別為53.45%和51.72%，敏感度明顯高于通常的細(xì)胞病毒分離。李啟明等[13]建立了檢測H5N1禽流感病毒基因的RT-LAMP方法。使用特異對應(yīng)于靶序列中8個(gè)基因區(qū)段的6條特異引物，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，對51份實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物及病毒培養(yǎng)標(biāo)本的H5N1亞型禽流感病毒的HA、NA基因區(qū)進(jìn)行了RT-LAMP檢測，并以SYBR Green I為反應(yīng)指示劑進(jìn)行了RT-LAMP，對該反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，經(jīng)對擴(kuò)增產(chǎn)物做內(nèi)切酶驗(yàn)證和測序分析，證明了RT-LAMP技術(shù)的特異性；同時(shí)，用10倍系列稀釋的RNA樣品對該檢測方法的靈敏度進(jìn)行了測試。結(jié)果顯示，利用RT-LAMP技術(shù)成功檢測到H5N1禽流感病毒的血凝素（HA）、NA基因區(qū)，且RT-LAMP與Real-time PCR結(jié)果呈現(xiàn)很好的一致性。此方法的靈敏度可達(dá)到能檢測10個(gè)拷貝RNA分子的水平。張坤等[14]針對H5N1禽流感病毒HA基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)LAMP外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物，以克隆的陽性質(zhì)粒為模板，對試驗(yàn)中的幾個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果LAMP檢測方法對H5N1禽流感病毒的靈敏度達(dá)到4～6個(gè)拷貝，其引物對于H1、H9亞型禽流感病毒和新城疫病毒無非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出良好的H5亞型特異性。侯佳蕾等[15]根據(jù)美國國家生物信息中心（GenBank）上登錄的H5亞型禽流感病毒（H5-AIV）血凝素基因序列，設(shè)計(jì)了一套特異識別HA基因序列中6個(gè)不同區(qū)段的LAMP引物，并以此套引物建立了一種基于LAMP技術(shù)的H5亞型禽流感病毒診斷方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對H5-AIV RNA的最小檢測限為10-6，靈敏性高于一步RT-PCR方法，全部反應(yīng)在1.5 h內(nèi)完成；在反應(yīng)體系中添加SYBR Green I染料后，可通過肉眼觀察有無熒光直接判定結(jié)果。靈敏性及特異性試驗(yàn)證明，該方法靈敏度高，特異性好，能夠作為H5亞型禽流感病毒的快速診斷方法。彭宜等[16]針對H9亞型禽流感病毒AIV的HA基因序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一套針對HA基因8個(gè)區(qū)域的6條特征性引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了適用于H9亞型禽流感病毒AIV的RT-LAMP方法。結(jié)果表明，該方法對H3、H5、H7亞型AIV及其他禽呼吸道病原體均無擴(kuò)增反應(yīng)，并可通過反應(yīng)液是否有沉淀或向反應(yīng)液中加入熒光染料來對結(jié)果進(jìn)行可視化觀察，且擴(kuò)增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中進(jìn)行，50 min之內(nèi)即可完成反應(yīng)。該方法對H9亞型AIV RNA的最小檢測限為0.01 pg，靈敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。蔣菲等[17]利用相似技術(shù)對H9亞型禽流感病毒AIVHA進(jìn)行了RT-LAMP方法的建立，最低可檢測到103拷貝的目的基因重組質(zhì)粒片段，較RT-PCR方法敏感10倍。通過對15種H亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒的檢測表明，該方法具有很好的特異性。在反應(yīng)體系中使用鈣黃綠素與Mn2+的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結(jié)果判定，并且其判斷結(jié)果與濁度判斷結(jié)果一致。對109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進(jìn)行檢測，RT-LAMP與RT-PCR檢出陽性樣本數(shù)分別為61份和46份，表明RT-LAMP方法的陽性檢出率高于RT-PCR。

1.2 LAMP技術(shù)在呼吸道細(xì)菌檢測方面的應(yīng)用 嗜肺軍團(tuán)菌于1976年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，主要通過污染建筑物中的水系傳播，易大規(guī)模暴發(fā)和流行。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、中央空調(diào)的普遍使用，軍團(tuán)菌爆發(fā)的危險(xiǎn)性日益增加。由于軍團(tuán)菌生長緩慢，普通培養(yǎng)檢測周期較長，血清免疫學(xué)方法靈敏度和特異性不高，因此其檢測存在一定的局限性。王水榮等[18]應(yīng)用LAMP針對嗜肺軍團(tuán)菌mip基因設(shè)計(jì)5條引物（2條內(nèi)引物、2條外引物及1條環(huán)引物）對LAMP反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并將該方法的特異性和敏感性與傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法及定量PCR方法比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP方法的檢出率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法及定量PCR，實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法能夠快速、靈敏、特異地檢測嗜肺軍團(tuán)菌。呂沁風(fēng)等[19]運(yùn)用LAMP設(shè)計(jì)一套引物特異性識別嗜肺軍團(tuán)菌mip基因的6個(gè)特殊區(qū)域，在恒溫條件下，對8株嗜肺軍團(tuán)菌和5株其他細(xì)菌進(jìn)行檢測，并與普通PCR方法進(jìn)行比對，驗(yàn)證該方法的特異性和靈敏度。結(jié)果所有嗜肺軍團(tuán)菌擴(kuò)增產(chǎn)物均產(chǎn)生肉眼可見的白色沉淀，而其他不同菌株均不產(chǎn)生沉淀；加入熒光染料Smart green后，嗜肺軍團(tuán)菌擴(kuò)增產(chǎn)物均產(chǎn)生強(qiáng)綠熒光，其他菌株呈弱熒光。與普通PCR（檢出限約為57.6 pg）比，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度大100倍左右，基因組DNA檢出限為576 fg，陽性水樣檢出限為8 CFU/ml。腦膜炎奈瑟菌（Nm）是流行性腦脊髓膜炎（流腦）的病原菌，人類是腦膜炎奈瑟菌唯一的易感宿主。李海清等[20]針對腦膜炎奈瑟菌屬（ctrA）基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條LAMP引物（2條內(nèi)引物和2條外引物），同時(shí)設(shè)計(jì)2條環(huán)引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。分別驗(yàn)證該方法的特異性及敏感性，并與普通PCR進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在適宜反應(yīng)條件所設(shè)計(jì)引物對腦膜炎奈瑟菌的擴(kuò)增的特異性及敏感性均較好，與普通PCR方法比較，LAMP敏感性比普通PCR高10倍。周義正等[21]針對肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）R6株的lytA基因序列設(shè)計(jì)特異LAMP引物，以鹽酸胍-苯甲醇法提取陽性血培養(yǎng)瓶中細(xì)菌DNA，以LAMP技術(shù)擴(kuò)增lytA基因，反應(yīng)條件為63℃45 min，采用肉眼觀察濁度和瓊脂糖電泳的方法來觀察結(jié)果。結(jié)果在196份陽性血培養(yǎng)瓶中，采用LAMP法檢測到肺炎鏈球菌16株，與傳統(tǒng)的方法比較，其檢測肺炎鏈球菌的靈敏度和特異度均達(dá)到100%，模擬標(biāo)本的檢測結(jié)果顯示該方法的最低檢測限為102CFU/ml。結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)周期較長，不利于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測。易海華等[22]根據(jù)結(jié)核分枝桿菌gyrB特征性序列設(shè)計(jì)的3對特征性引物對痰液中和培養(yǎng)基中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測。其中1對環(huán)狀引物結(jié)合于特征性序列中環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分，可極大地加快LAMP反應(yīng)速度，且不干擾內(nèi)引物在LAMP反應(yīng)中作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用環(huán)狀引物的LAMP反應(yīng)可在0.5 h內(nèi)完成，總共分析時(shí)間不超過1 h。LAMP檢測技術(shù)的靈敏度比經(jīng)典PCR技術(shù)高100倍左右，具有與實(shí)時(shí)PCR（Real-time PCR）技術(shù)相同的特異度。

1.3 LAMP技術(shù)在食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用 食品安全是近年社會(huì)關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。食源性疾病與食品污染構(gòu)成了一個(gè)巨大并不斷擴(kuò)大的公共衛(wèi)生問題。自2002年起，我國建立了國家食源性病原菌監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，為食品安全和風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)依據(jù)。在食品污染所引發(fā)的腸道疾病中，不耐熱型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）是引起食物中毒的常見腸道致病菌之一。羅海等[23]選用不耐熱腸毒素（LT）編碼基因的6個(gè)保守區(qū)設(shè)計(jì)LAMP引物，優(yōu)化dNTPs濃度、Bst DNA聚合酶濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等反應(yīng)條件，評估該方法的特異性和靈敏性。結(jié)果顯示，該方法檢測不耐熱型產(chǎn)腸毒素大腸桿菌時(shí)間短，特異性較好，靈敏度高。沙門菌屬是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原體之一，也是腸桿菌科中最復(fù)雜的菌屬。2003-2005年食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示沙門菌占微生物食源性疾病的17.19%，排在第2位[24]。歐新華等[25]針對沙門菌屬侵襲蛋白（invA）基因序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條LAMP引物，65℃保溫約60 min完成對沙門菌屬的擴(kuò)增。利用LAMP和普通PCR方法同時(shí)檢測4株沙門菌和9株非沙門菌（對照組）來驗(yàn)證該方法的特異性，將腸炎沙門菌菌液做一系列10倍稀釋后用LAMP和PCR方法進(jìn)行檢測，比較兩者敏感性。4株沙門菌擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶，9株非沙門菌未出現(xiàn)LAMP擴(kuò)增，產(chǎn)物的特異性通過限制性內(nèi)切酶得到證實(shí)。LAMP檢測沙門菌屬的特異性與普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP檢測沙門菌屬的檢測下限為10 CFU/ml，PCR檢測下限為100 CFU/ml。LAMP檢測速度相比PCR更快速，在60 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。朱勝梅等[26]根據(jù)沙門菌特異性invA基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行LAMP，同時(shí)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了沙門菌LAMP快速檢測技術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP的最佳反應(yīng)條件為外引物濃度5 pmol/L、內(nèi)引物濃度為40 pmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTP濃度為0.8 mmol/L，甜菜堿濃度0.8 mmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，反應(yīng)溫度63℃，反應(yīng)時(shí)間1 h，在此條件下LAMP檢測到沙門菌DNA的敏感度達(dá)10 fg時(shí)反應(yīng)，且與其他常見的細(xì)菌無交叉反應(yīng)，對牛奶樣品的檢出量為102CFU/ml。易海華等[27]針對志賀菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因（ipaH）特征性保守序列設(shè)計(jì)1套4條引物，應(yīng)用LAMP技術(shù)對21株志賀菌和非志賀菌進(jìn)行特異性檢測以確定其特異性；使用LAMP和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對ipaH基因重組質(zhì)粒倍比稀釋液進(jìn)行檢測以確定其靈敏度；使用重組質(zhì)粒計(jì)算其初始拷貝數(shù)與反應(yīng)時(shí)間之間的線性關(guān)系以評估定量檢測的可能性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LAMP技術(shù)可以在1 h內(nèi)獲得結(jié)果；有較好的特異性，與其他17種食源性致病菌無交叉反應(yīng)；LAMP檢測技術(shù)的靈敏度高出經(jīng)典PCR技術(shù)10倍以上，檢測限達(dá)到200拷貝/μl，平均變異系數(shù)＜5%；反應(yīng)時(shí)間與模板初始濃度有良好的線性關(guān)系（r2=0.9855）。徐芊等[28]針對副溶血性弧菌不耐熱溶血素基因（tdh）設(shè)計(jì)4條特異性引物（兩條內(nèi)引物和兩條外引物）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min，反應(yīng)溫度為60℃。對12種細(xì)菌共28株菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，僅副溶血性弧菌得到陽性擴(kuò)增結(jié)果，證明引物具有很高的特異性。副溶血性弧菌基因組DNA和純培養(yǎng)物的檢測靈敏度分別為90 fg和24 CFU/ml。對模擬食品樣品進(jìn)行檢測，檢測限為89 CFU/g，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程1 h即可完成。易海華等[29]針對金黃色葡萄球菌clfA基因保守序列，根據(jù)LAMP方法的原理，設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)體系和程序，對方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性及初始拷貝數(shù)的對數(shù)值與反應(yīng)時(shí)間（熒光信號值為1×104時(shí)對應(yīng)的時(shí)間）之間的線性關(guān)系進(jìn)行評估。結(jié)果使用LAMP方法可以在0.5 h內(nèi)獲得檢測結(jié)果，LAMP檢測技術(shù)的靈敏度高出經(jīng)典PCR技術(shù)10倍以上，與其他相關(guān)致病菌無交叉反應(yīng)，平均試驗(yàn)間變異系數(shù)小于5%，反應(yīng)時(shí)間與模板濃度有良好的線性關(guān)系（r2=0.9501），LAMP法檢測臨床樣本中金黃葡萄球菌的靈敏度為100%，特異度為94.4%，符合性為96.6%。申建維等[30]利用包被有SPA單克隆抗體的磁珠富集樣品中的金黃色葡萄球菌，快速提取其DNA，用LAMP擴(kuò)增金黃色葡萄球菌耐藥基因mecA,擴(kuò)增條件為65℃保溫1 h。在反應(yīng)過程中，熒光探針與mecA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)序列結(jié)合，產(chǎn)生熒光，通過檢測反應(yīng)管中的熒光值來判定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的最低檢測限為10 CFU/ml，與M-H培養(yǎng)基苯唑西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比較，靈敏性為99%，特異性為90.9%；與PCR方法比較，敏感性為100%，特異性為100%；實(shí)驗(yàn)時(shí)間縮短1 h。齊哲等[31]針對蠟樣芽胞桿菌的溶血素基因hblA設(shè)計(jì)引物，將FTA濾膜提取DNA與LAMP法相結(jié)合，檢測蠟樣芽胞桿菌和人工污染蠟樣芽胞桿菌的消毒乳。結(jié)果表明，LAMP對抽提的DNA最低檢出濃度為4.4 CFU/ml，比PCR檢測靈敏度高10倍。人工污染消毒乳中蠟樣芽胞桿菌的檢出限為57 CFU/ml。LAMP擴(kuò)增最短可在20 min內(nèi)完成，對消毒乳中蠟樣芽胞桿菌的整個(gè)檢測（包括DNA提取、LAMP和電泳）可在2 h內(nèi)完成。空腸彎曲菌是世界上公認(rèn)的引起急性腹瀉和腸胃炎的主要病原菌。林超等[32]以空腸彎曲菌的促旋酶基因A（gyrA）設(shè)計(jì)引物建立空腸彎曲菌的LAMP快速檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性，與細(xì)菌平板計(jì)數(shù)和PCR法的靈敏度比較，LAMP檢測與PCR法有相近的靈敏度，比細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法靈敏度高3個(gè)數(shù)量級。研究結(jié)果還表明，提取核酸前加入DNase可以有效地減少死菌DNA對LAMP結(jié)果的影響。單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種能夠引起人獸共患疾病的食源性致病菌，WHO已將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一，主要能引起人與動(dòng)物的腦炎、菌血癥、流產(chǎn)、無敗血癥性單核細(xì)胞增多癥等，尤其是免疫力低下者、嬰幼兒、老年人、孕婦等易受感染而發(fā)病。唐夢君等[33]根據(jù)LM hlyA基因序列中的保守區(qū)域進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，結(jié)果建立的LAMP方法能成功擴(kuò)增出梯形條帶，LAMP檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌純培養(yǎng)物和人工染菌的靈敏度為5.44×102CFU/ml，而對照PCR檢測的靈敏度為5.44×104CFU/ml，對10株細(xì)菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，僅單核細(xì)胞增生李斯特菌得到陽性結(jié)果，從DNA提取到報(bào)告結(jié)果耗時(shí)僅1 h。張?bào)w銀等[34]同樣針對單增李斯特菌hly基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行DNA等溫?cái)U(kuò)增。3株單增李斯特菌均擴(kuò)增出特異性目的片段，而10株非單增李斯特菌均未產(chǎn)生目的片段，特異性為100%，無假陽性和假陰性出現(xiàn)。用LAMP在65℃條件下1 h內(nèi)即可檢出單增李斯特菌，靈敏度達(dá)100 CFU/ml。用該方法與國標(biāo)方法分別檢測50種樣品中的單增李斯特菌，兩種方法的符合率達(dá)到100%。魯曦等[35]針對阪崎腸桿菌16s RNA基因設(shè)計(jì)4條引物特異性識別靶基因的六個(gè)特殊區(qū)域，建立了一套嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌快速檢測的LAMP方法。該方法能夠在5 h內(nèi)檢測出復(fù)原乳樣品中101 CFU/ml的阪崎腸桿菌，檢測阪崎腸桿菌基因組DNA的靈敏度為100 fg，不僅能夠用于嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌的檢測，而且滿足了對嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌快速檢測的迫切需要。朱水榮等[36]針對EHEC O157：H7的O157抗原編碼rfbE、志賀樣毒素stx2、H7鞭毛抗原編碼fliC基因分別設(shè)計(jì)引物，并對LAMP反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。對2株背景明確的實(shí)驗(yàn)對照菌EHEC O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株、17株O157地方分離株、33株非O157其他腸道菌株進(jìn)行檢測，并與PCR結(jié)果比較，驗(yàn)證該方法的特異性、敏感性。結(jié)果顯示具有相應(yīng)靶基因的O157菌株經(jīng)LAMP的檢測結(jié)果均與PCR法相同，呈綠色且電泳有相應(yīng)條帶為陽性，非O157其他腸道菌株均檢測呈橙色并電泳無相應(yīng)條帶為陰性。反應(yīng)體系檢測限為26 CFU/ml，且結(jié)果在白光下通過肉眼即可判斷。朱海等[37]選取E.coli O157：H7的rfbE基因設(shè)計(jì)LAMP引物，優(yōu)化建立LAMP檢測體系。并用該體系和國標(biāo)法對76份人工污染樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果所建立的E.coli O157：H7 LAMP體系具有良好的特異性，用該體系對9屬13種41株菌進(jìn)行檢測，結(jié)果只有E.coli O157：H7的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果為階梯狀條帶，非E.coli O157：H7均未產(chǎn)生擴(kuò)增引物，靈敏性為27 CFU/ml。樣品及培養(yǎng)基對反應(yīng)體系無影響或影響很小。對76份樣品進(jìn)行了檢測，E.coli O157：H7 LAMP檢測方法與國標(biāo)法的總符合率為96.1%，2 h內(nèi)即可完成檢測。徐義剛等[38]基于EHEC O157：H7保守的rfbE基因序列，設(shè)計(jì)4條引物，成功建立了EHEC O157：H7 LAMP快速檢測方法，60 min內(nèi)即可完成致病菌檢測。利用該方法對30種共38株細(xì)菌進(jìn)行檢測，所試EHEC O157：H7均為陽性結(jié)果，說明該方法具有高度的特異性。該方法對純培養(yǎng)的EHEC O157：H7檢出限為12 CFU/ml，污染食品中EHEC O157：H7的檢出限為18 CFU/g。實(shí)踐應(yīng)用表明，對1 121份進(jìn)出口肉類、奶類制品及人工污染樣品進(jìn)行檢測，檢出57份LAMP陽性，與采用AOAC標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果的符合率為100%。霍亂是由霍亂弧菌引起的，以腹瀉為主要癥狀的烈性傳染病，在我國屬于甲類傳染病。朱水榮等[39]應(yīng)用LAMP針對O139霍亂弧菌wbfR基因設(shè)計(jì)4條引物（2條內(nèi)引物和2條外引物），優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，并對13株種系背景明確的霍亂弧菌不同實(shí)驗(yàn)對照株、30株O139群霍亂弧菌地方分離株、10株O1群霍亂弧菌地方分離株、32株其他腸道菌進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性，通過肉眼目測或電泳檢測比較結(jié)果。結(jié)果所有O139群霍亂弧菌經(jīng)LAMP檢測均呈綠色電泳有階梯狀條帶為陽性，O1群霍亂弧菌及其他腸道菌均檢測呈橙色并電泳無相應(yīng)條帶為陰性；該體系最低檢測限為63 CFU/ml。該研究建立的LAMP方法能夠快速、靈敏、特異地檢測O139群霍亂弧菌，無需昂貴的儀器，簡單方便，非常適合基層檢驗(yàn)部門或小型實(shí)驗(yàn)室以及流行病學(xué)人員于應(yīng)急車上或現(xiàn)場監(jiān)測等使用，值得推廣。嗜水氣單胞菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株對水產(chǎn)動(dòng)物、家畜和人均有致病作用，在動(dòng)物疾病學(xué)和食品衛(wèi)生學(xué)研究上都具有重要意義。程天印等[40]基于嗜水氣單胞菌氣溶素基因的序列，設(shè)計(jì)了一套引物，通過條件優(yōu)化，成功建立了針對致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測法。結(jié)果表明該法只檢出致病性嗜水氣單胞菌，對不同濃度的細(xì)菌懸液擴(kuò)增結(jié)果表明LAMP檢測嗜水氣單胞菌的最低菌液濃度為1.4～14 CFU/μl，高于普通PCR方法。

1.4 LAMP技術(shù)在腸道病毒檢測方面的應(yīng)用 諾如病毒是繼輪狀病毒后引起非細(xì)菌性急性腸胃炎的主要病原之一，常通過糞口途徑傳播。陳宗峰等[41]采用RT-LAMP擴(kuò)增諾如病毒特異性基因，并與RT-PCR方法比較。結(jié)果RT-LAMP法更加簡便快速、特異性好、具有更高的靈敏度、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，為臨床檢測諾如病毒快速簡便的新方法。手足口?。℉and foot and mouth disease，HFMD）自1957年首次報(bào)告以來，世界各地不斷出現(xiàn)新疫情，其流行呈明顯上升趨勢。HFMD可由多種病毒引起，其中腸道病毒71型（EV71）是導(dǎo)致HFMD最重要的病原體。耿英芝等[42]針對EV71 VP1基因的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異性引物，建立檢測該靶序列的RT-LAMP方法，對其特異性和敏感性進(jìn)行了驗(yàn)證，并對手足口病患者標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與RT-PCR及Real-time PCR方法進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用RT-LAMP方法能成功檢測到EV71 VP1基因區(qū)，等溫條件下60 min內(nèi)即可完成檢測，該方法簡便快捷、敏感性高、特異性好，其陽性率高于RT-PCR方法（P＜0.05），與Real-time PCR結(jié)果呈現(xiàn)良好的一致性（P＞0.05），適用于EV71感染的快速檢測及分子流行病學(xué)的監(jiān)測，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

1.5 LAMP技術(shù)在寄生蟲檢測方面的應(yīng)用 弓形蟲是一種嚴(yán)重危害人類及家畜的機(jī)會(huì)性致病原蟲，呈世界級分布，可侵犯除成熟紅細(xì)胞以外的任何有核細(xì)胞，引起多種組織、器官病變和損害。李月梅等[43]研究建立了弓形蟲快速檢測的LAMP方法。用10倍系列稀釋的DNA樣品對該檢測方法的靈敏度進(jìn)行了測試，此方法的靈敏度可達(dá)到能檢測5個(gè)拷貝DNA分子水平，擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)切酶驗(yàn)證結(jié)果正確；成功檢測到弓形蟲基因區(qū)，對新孢子蟲、附紅細(xì)胞體、瑟氏泰勒蟲等病原體檢測均為陰性，顯示出較強(qiáng)的特異性。楊秋林等[44]用酚-氯仿法提取弓形蟲速殖子基因組DNA，設(shè)計(jì)兩對擴(kuò)增弓形蟲B1基因的LAMP引物。以間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卡氏肺孢子蟲、日本血吸蟲及小鼠白細(xì)胞做對照進(jìn)行LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)SYBR GreenⅠ顯色及電泳后觀察結(jié)果，將弓形蟲速殖子經(jīng)倍比稀釋為（2～3）×106個(gè)/ml等8個(gè)濃度進(jìn)行LAMP反應(yīng)驗(yàn)證該方法的敏感性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，弓形蟲速殖子檢測管經(jīng)顯色后呈綠色為陽性，LAMP產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈特征性梯狀條帶，對照組均無擴(kuò)增產(chǎn)物。LAMP技術(shù)可檢測到的弓形蟲速殖子最低濃度為2～3個(gè)/ml。尾蚴是日本血吸蟲的感染期，檢測水體尾蚴的有無，可為安全用水、預(yù)防人畜感染提供依據(jù)，現(xiàn)用的尾蚴檢測方法操作較繁瑣。楊秋林等[45]使用基因釋放劑快速提取尾蚴基因組DNA，設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增尾蚴鈣結(jié)合蛋白基因的LAMP，以華支睪吸蟲為陰性對照進(jìn)行LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)顯色、電泳鑒定。用細(xì)吸管在解剖鏡下分別吸取20條、10條、5條、1條尾蚴進(jìn)行LAMP反應(yīng)檢測其敏感性。結(jié)果尾蚴檢測管經(jīng)顯色后呈綠色（陽性），對照組呈棕色（陰性），產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，對照組無擴(kuò)增產(chǎn)物，LAMP可檢測到尾蚴的最低數(shù)量為1條。間日瘧原蟲（Plasmodium vivax，P.V）是間日瘧的病原體。瘧疾的傳統(tǒng)檢查方法是血膜涂片經(jīng)染色后鏡檢，該法簡便、成本低，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且容易漏診。楊秋林等[46]用酚-氯仿法提取P.V基因組DNA，設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增P.V環(huán)子孢子蛋白基因的LAMP引物，以惡性瘧原蟲、弓形蟲、人全血DNA為對照進(jìn)行LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)顯色、電泳鑒定。將P.V血樣用健康人血做1.5×10-3～1.5×10-86個(gè)濃度后進(jìn)行LAMP檢測其敏感性。結(jié)果P.V LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測管顯色后呈陽性，對照組均為陰性。產(chǎn)物電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，對照組均無擴(kuò)增條帶。LAMP檢測P.V的敏感度為1.5個(gè)瘧原蟲/107RBC?？ㄊ戏捂咦酉x（Pneumocystis carinii，Pc）寄生于哺乳動(dòng)物肺部，引起卡氏肺孢子蟲肺炎（PCP），由于PCP的病原學(xué)檢查困難，健康人群抗體陽性率高達(dá)50%～60%，故檢測抗體也不適于PCP的診斷。楊秋林等[47]用醋酸可的松經(jīng)皮下注射Wistar大鼠誘導(dǎo)Pc基因，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）提取Pc基因組DNA。設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增Pc線粒體核糖體大亞基（mtrRNA）基因的LAMP引物，以結(jié)核桿菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、弓形蟲、大鼠白細(xì)胞為對照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。LAMP產(chǎn)物經(jīng)顯色、電泳及酶切鑒定。將Pc DNA稀釋10倍后同時(shí)進(jìn)行LAMP和PCR，比較其敏感性。結(jié)果Pc檢測管經(jīng)顯色后呈綠色（陽性），對照組均呈棕色（陰性）。Pc LAMP產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈LAMP特征性梯狀條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Tail限制性內(nèi)切酶酶切鑒定正確，對照組均無擴(kuò)增產(chǎn)物。LAMP可檢測到蟲體DNA的最低濃度是1 pg/μl，為PCR的10倍。

2 結(jié) 語

LAMP方法是本世紀(jì)發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)技術(shù)，雖然還存在著諸多的缺點(diǎn)和不足，但其在多個(gè)領(lǐng)域表現(xiàn)出來的特異性高、敏感性好、便捷快速等優(yōu)點(diǎn)使其在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)微生物檢測方面的應(yīng)用顯示出了令人鼓舞的前景。該方法不需昂貴的PCR儀和特殊檢測試劑，尤其適合在基層檢測機(jī)構(gòu)微生物實(shí)驗(yàn)室的推廣和應(yīng)用。

LAMP技術(shù)雖然原理復(fù)雜，特別是引物的設(shè)計(jì)相當(dāng)專業(yè)，其難點(diǎn)主要在于如何從200～300個(gè)堿基的靶序列中設(shè)計(jì)4條符合要求的引物。但這些都可以由專業(yè)的研究單位和試劑公司來完成，對檢測人員而言其操作卻是十分方便。若開發(fā)研究相應(yīng)的檢測試劑盒，必然會(huì)有巨大的市場前景，該技術(shù)也有望成為簡易的常規(guī)檢測手段。

隨著LAMP技術(shù)的不斷研究和改進(jìn)，其在微生物檢測領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加重要的作用。堅(jiān)信隨著技術(shù)的不斷完善，該方法作為分子生物學(xué)的一種快速檢測技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于各種病原體的快速檢測和疾病的快速診斷，為及時(shí)控制傳染病疫情和應(yīng)對公共衛(wèi)生突發(fā)事件提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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