離體葉綠體熒光觀察實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)研究

黃國(guó)文

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)和化學(xué)工程系，湖南 永州 425100）

葉綠體是植物特有的細(xì)胞器，是光合作用的場(chǎng)所。1931年Kaustky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象[1]。將暗適應(yīng)的綠色植物或含有葉綠素的組織突然暴露在可見光下，葉綠體的熒光快速上升然后下降到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，這一現(xiàn)象稱為Kautsky效應(yīng)。熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間變化的曲線稱為葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線。在普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)中開設(shè)了綜合性的“葉綠體的分離和熒光觀察”實(shí)驗(yàn)[2]，目的是使學(xué)生了解葉綠體的制備方法和葉綠體熒光產(chǎn)生的機(jī)理，了解熒光強(qiáng)度與光合作用的關(guān)系以及葉綠體活性與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)生物現(xiàn)象的觀察和理解能力以及運(yùn)用知識(shí)解決實(shí)際問題的能力。但是在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)于用差速離心法制備離體葉綠體和觀察其熒光現(xiàn)象的步驟，大多數(shù)學(xué)生不能很好地和獨(dú)立地完成。本人根據(jù)這種實(shí)際情況，研究了存在這種現(xiàn)象的原因，設(shè)計(jì)了一個(gè)離體葉綠體的制備和熒光現(xiàn)象觀察的新方法—質(zhì)壁分離法分離離體葉綠體并觀察其熒光。應(yīng)用這種方法取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。

1 建立本方法的依據(jù)

1.1 葉綠體熒光現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理

當(dāng)葉綠體中葉綠素分子吸收光能（光量子）后，其中的電子由低能級(jí)（基態(tài)）激發(fā)為高能電子（激發(fā)態(tài)）。不同光質(zhì)激發(fā)的高能電子出現(xiàn)在不同的軌道中旋轉(zhuǎn)。如果葉綠素分子被藍(lán)光（430nm）激發(fā)，葉綠素中的電子躍遷到能量較高的軌道稱為第二單線態(tài)；如果被紅光（670 nm）激發(fā)，電子躍遷到能量較低的軌道旋轉(zhuǎn)稱為第一單線態(tài)。處于第一和第二單線態(tài)的電子，其自旋方向保持原來狀態(tài)，如果電子在激發(fā)或退激過程中自旋方向發(fā)生變化，該電子就進(jìn)入能級(jí)較單線態(tài)低的軌道稱為三線態(tài)。這些高能態(tài)電子很不穩(wěn)定，經(jīng)過一定時(shí)間后，其能量可以同時(shí)向三個(gè)方面轉(zhuǎn)化[3]。一種形態(tài)是第二單線態(tài)的高能電子返回第一單線態(tài)以及第一單線態(tài)和三線態(tài)的高能電子返回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生熱量，第二種形態(tài)是第一單線態(tài)的高能電子會(huì)傳遞給內(nèi)囊體膜上的電子傳遞鏈參與光化學(xué)反應(yīng)和葉綠體基質(zhì)中進(jìn)行有機(jī)物合成，第三形態(tài)是第一單線態(tài)和三線態(tài)高能電子返回基態(tài)產(chǎn)生熒光和磷光。熒光的壽命很短，只有10-8- 10-10s。這三種能量形態(tài)以競(jìng)爭(zhēng)的方式出現(xiàn)，以至任何一種能量形態(tài)效率的增加會(huì)導(dǎo)致其它兩個(gè)種能量形態(tài)產(chǎn)量的減少[4]。正常條件下植物捕獲的光能主要用于光化學(xué)反應(yīng)，剩余的能量以熒光、熱耗散等方式被耗散掉[5]。葉綠素分子吸收藍(lán)光后躍遷到較高能級(jí)第二單線態(tài)的高能電子要返回能級(jí)較低的第一單線態(tài)才能用于光合作用，多余的能量也是以熱的形式耗散。因此，植物進(jìn)行光合作用時(shí)對(duì)紅光的能量利用率的高于對(duì)藍(lán)光的能量利用率。

1.2 葉綠體熒光淬滅現(xiàn)象

在葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)過程中，熒光由最高值降至穩(wěn)態(tài)，這種熒光產(chǎn)量的下降稱為葉綠素?zé)晒獯銣纭Ｔ谌~綠體的分離過程中，在2 min內(nèi)葉綠體的熒光減少到穩(wěn)定態(tài)[6]。在有機(jī)溶劑中葉綠素的熒光產(chǎn)量大約為30%，然而在進(jìn)行光合作用的葉綠體的熒光產(chǎn)量為0.5-3%，這種現(xiàn)象也稱為熒光淬滅。它包括光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅。光化學(xué)淬滅是指葉綠體的電子傳遞鏈處于氧化態(tài)，反應(yīng)中心開放，會(huì)發(fā)生電子傳遞和電荷分離，形成ATP等產(chǎn)生熒光淬滅，反映出PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的分額和QA的氧化狀態(tài)。非光化學(xué)淬滅是指PSⅡ天線色素分子吸收了過量的光能不能用于光合電子傳遞而以熱耗散造成的光能產(chǎn)量降低。有機(jī)體為了免于過量光吸收的損害，產(chǎn)生了非光化學(xué)淬滅途徑。在一個(gè)光合作用驅(qū)動(dòng)的系統(tǒng)中，葉綠體的熒光淬滅提供了一個(gè)葉綠素被光激發(fā)與原初轉(zhuǎn)換反應(yīng)之間的關(guān)系[7]。所以實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，用前進(jìn)行充分光照，以保證葉綠體和葉綠素的活性。

2 質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體的方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

生活細(xì)胞的原生質(zhì)膜是一種選擇性透過膜。當(dāng)細(xì)胞外的溶液濃度較高（高滲溶液）時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分便向外滲出，引起質(zhì)壁分離。然后鋒利的刀片將已經(jīng)發(fā)生質(zhì)壁分離的葉片切碎，一部分細(xì)胞的細(xì)胞壁被切去。將葉片放在低滲溶液時(shí)原生質(zhì)體吸水，發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原，這時(shí)原生質(zhì)體從細(xì)胞壁的破口處釋放出來。用等滲溶液(0.35 mol/L NaCl 或者0.4 mol/L蔗糖溶液)處理原生質(zhì)體，原生質(zhì)體破裂釋放出葉綠體?？梢杂糜谟^察葉綠體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和熒光現(xiàn)象。

2.2 操作步驟

① 取一片葉,用刀片在背面劃十字(注意：不要?jiǎng)澠迫~片)并且挑起下表皮。用鑷子從四個(gè)角撕去下表皮。切成0.5 ×0.5 cm2左右的小塊，轉(zhuǎn)入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的注射器中推拉幾次推桿，抽去葉片中的氣體。再轉(zhuǎn)入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的表面皿中浸泡10-20min。② 取3-4小塊葉片放入載波片上滴有幾滴0.9 mol/L NaCl溶液中，用刀片成條狀切碎。③離體葉綠體的分離： 將條狀切塊分批轉(zhuǎn)移到另外一塊載玻片滴有一滴0.35 mol/L NaCl溶液中，片刻后，用鑷子小心搗動(dòng)并去掉葉片碎塊。此時(shí)，溶液中葉肉原生質(zhì)體流出、破裂并釋放出葉綠體，蓋上蓋玻片。這時(shí)可以觀察葉綠體及其熒光。注意，在載玻片上0.35 mol/L NaCl溶液中多放些葉片碎塊應(yīng)以溶液淹沒為度。在溶液中分批轉(zhuǎn)入碎塊是為了收獲更多的葉綠體。在載玻片上滴0.9 mol/L NaCl溶液時(shí)不能過多，以覆蓋0.5 × 0.5 cm2的小塊葉片為宜，溶液過多時(shí)用吸水紙吸去一部分，以防止溶液外溢。如果想獲得完整的原生質(zhì)體，可以將②中的條狀碎塊轉(zhuǎn)移到載玻片上含有一滴0.6 mol/L NaCl溶液中即可。

2.3 本方法的優(yōu)點(diǎn)

一般情況下，制備植物葉綠體的方法是差速離心法。用這種方法分離葉綠體的操作條件要求較高。因?yàn)槿~綠體活力會(huì)隨著離體時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，因此，如果在常溫下操作，應(yīng)該盡可能在短時(shí)間內(nèi)完成。一般要求在0-4℃條件下完成操作步驟，使離體葉綠體活性保存時(shí)間長(zhǎng)些。但是在實(shí)驗(yàn)過程中一個(gè)班( 30 - 40人)同時(shí)進(jìn)行、離心機(jī)和熒光顯微鏡通常為多人共用, 難以做到迅速分離和觀察。此外，研磨葉片時(shí)不要用力過猛和連續(xù)研磨以及研磨過細(xì)，應(yīng)以不延續(xù)研磨和把葉片研磨成小塊為宜，在沒有進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的情況下研磨葉片時(shí)的力度和研磨次數(shù)難以掌握。研磨液需要用4層紗布過濾，濾液要經(jīng)過逐級(jí)離心才能分離出葉綠體，這樣葉綠體在體外的時(shí)間較長(zhǎng)，增加了葉綠體熒光淬滅和活性喪失的機(jī)會(huì)。一次實(shí)驗(yàn)要使用較多材料（30 g左右）來提取葉綠體，否則經(jīng)過研磨、過濾和分級(jí)離心以后得到的葉綠體的數(shù)量非常少，這樣也減少了每個(gè)學(xué)生動(dòng)手操作實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)。

運(yùn)用質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體，操作簡(jiǎn)單，不需要組織搗碎機(jī)和離心機(jī)等設(shè)備。所用的實(shí)驗(yàn)材料少，適合每一位同學(xué)動(dòng)手操作實(shí)驗(yàn)。制備葉綠體的步驟少，所需的時(shí)間短，可以有效保存葉綠體的活性，減少葉綠體熒光淬滅的機(jī)會(huì)，觀察到的葉綠體的熒光現(xiàn)象明顯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果好。

3 觀察葉綠體熒光現(xiàn)象

3.1 離體葉綠體與細(xì)胞內(nèi)的葉綠體熒光強(qiáng)度比較

將制備好的離體葉綠體裝片和葉肉裝片放在熒光顯微鏡下觀察，可見離體葉綠體的熒光要比細(xì)胞內(nèi)的葉綠體的要亮。這是由于離體葉綠體光合作用的光反應(yīng)受阻引起的。因?yàn)橹参锕夂献饔玫墓夥磻?yīng)在葉綠體類囊體薄膜上進(jìn)行。葉綠素分子吸收光能，被激發(fā)出一個(gè)高能電子。這個(gè)電子則在類囊體膜上的電子傳遞鏈傳遞下去，并將 H+質(zhì)子從葉綠體基質(zhì)泵入到類囊體腔，建立電化學(xué)質(zhì)子梯度，用于 ATP的合成，NADP+接受高能電子被還原為NADPH。葉綠素分子由于失去一個(gè)電子，就留下一個(gè)空穴，只得從周圍的水分子中奪得電子，因而促使水的分解。由于離體葉綠體基質(zhì)中ADP+和NADP+和CO2有限，不能從細(xì)胞質(zhì)中得到補(bǔ)充，高能電子的傳遞受阻，其能量重新以熒光形式發(fā)射出來，所以其熒光強(qiáng)度較亮；在同等光照強(qiáng)度的情況下，細(xì)胞內(nèi)的葉綠體的光合作用能夠順利進(jìn)行，葉綠素分子吸收光照產(chǎn)生的激發(fā)能主要用于光合作用，葉綠素發(fā)射的熒光量子就少，其熒光強(qiáng)度就低[8]。同樣地，離體葉綠素的熒光比細(xì)胞內(nèi)的熒光要強(qiáng)。這是因?yàn)殡x體葉綠素沒有結(jié)合在葉綠體中的類囊體上，葉綠素分子受到光能激發(fā)產(chǎn)生的高能電子的能量不能傳遞到電子傳遞鏈重新被發(fā)射出來，所以熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；然而細(xì)胞中葉綠素分子結(jié)合在類囊體上，在同等光照強(qiáng)度的情況下葉綠素分子受到光能激發(fā)產(chǎn)生的高能電子的能量能可以傳遞到電子傳遞鏈進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，能夠被發(fā)射出來的熒光量就少，所以熒光強(qiáng)度就弱。

3.2 不同濾光片下葉綠體自發(fā)熒光的比較

在熒光顯微鏡下?lián)Q用不同濾光片觀察葉綠體裝片，可見葉綠體的自發(fā)熒光會(huì)發(fā)生變化，葉綠體的顏色相應(yīng)地發(fā)生改變。這是因?yàn)槿~綠體的熒光特征基本上是由吸收光的色素、激發(fā)能的轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生熒光色素的特性決定的，也受反應(yīng)中心和 PSⅡ的電子供體和電子受體的還原狀態(tài)的影響，還受溫度、光照強(qiáng)度、水分等環(huán)境因素的影響。在植物體內(nèi)由于激發(fā)能從ch1b 向ch1a 的傳遞效率幾乎達(dá)到100% , 所以PSⅠ色素系統(tǒng)基本不發(fā)熒光，檢不出體內(nèi)ch1b 的熒光。在室溫下，細(xì)胞內(nèi)和離體葉綠體的熒光幾乎都是來源于 PSⅡ的Chl a，發(fā)射的熒光產(chǎn)量和動(dòng)力學(xué)是與PSⅡ的原初光化學(xué)反應(yīng)密切相連的[9,10]。植物進(jìn)行光合作用時(shí)，葉綠體分子吸收的光主要是藍(lán)光和紅光(400-700 nm, 它被稱為光合作用有效輻射)，然而葉綠體產(chǎn)生的熒光主要在紅光至幾乎紅外光(660-800 nm)區(qū)。葉片中葉綠素產(chǎn)生的熒光有兩個(gè)最大值：紅光區(qū)（大約686-690 nm）和遠(yuǎn)紅光區(qū)（大約730-740 nm）[11]，所以熒光是葉綠素吸收光能以后重新以光的形式發(fā)射出來的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。在介質(zhì)中沒有添加輔助因子（維生素C、維生素K13，AMP + Mg2++ FMN + TPN）的離體葉綠體的熒光誘導(dǎo)現(xiàn)象比完整葉片里的葉綠體的熒光誘導(dǎo)現(xiàn)象明顯地簡(jiǎn)單[12]。

總之，運(yùn)用質(zhì)壁分離法制備離體葉綠體和熒光觀察的方法，能夠克服用差速離心法制備葉綠體耗時(shí)、葉綠體活性難以保證等缺點(diǎn)；能夠清楚地觀察到離體葉綠體的自發(fā)熒光現(xiàn)象，也為觀察葉綠體的次生熒光現(xiàn)象打下了基礎(chǔ)。在我校生物技術(shù)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，運(yùn)用這一方法，每一組的學(xué)生都能動(dòng)手完成實(shí)驗(yàn)，能夠制備到有活性的離體葉綠體并且清楚地觀察到熒光現(xiàn)象的學(xué)生人數(shù)達(dá)到95%以上。這一方法將會(huì)在今后的學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)教學(xué)中得到有效的應(yīng)用。

[1]Govindjee.Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence[J].Aust J Plant Physiol, 1995, 22: 131—160.

[2]彭玲主編.普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2009,p65.

[3]Rohácek K, and Barták M.Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters,and some applications[J].Photosynthetica, 1999, 37:339-363.

[4]Maxwell K, Johnson GN.Chlorophyll fluorescence - a practical guide[J].Journal of Experimenral Botany, 2000,51:659-668.

[5]Krause GH and Weis E.Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 319-349.

[6]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.

[7]Arnon DI, TsuJimoto HY, and Mcswain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphoryla tion and electron transfer[J].Biochemistry, 1965, 54:927-934.

[8]Arnon DI, Tsujimoto HY, and McSwain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphorylation and electron transfer[J].PNAS, 1965, 54:927-934.

[9]Homann PH.Cation Effects on the Fluorescence of Isolated Chloroplasts[J].Plant Physiol.1969, 44, 932-936.

[10]Oxborough K.Imaging of chlorophyll a fluorescence:Theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance[J].Journal of Experimental Botany, 2004, 55: 1195- 1205.

[11]Buschmann C .Variability and application of the chlorophyll fluorescence emission ratio red/far-red of leaves[J].Photosynthesis Research, 2007,92: 261-271.

[12]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.