外源性孕酮對去勢大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

胡志英 方馬榮 王 靜

孕酮治療月經(jīng)病已廣泛應(yīng)用于臨床，近年研究表明，其作用遠(yuǎn)超出生殖功能范疇，被稱為“活性神經(jīng)類固醇”。但有關(guān)它對學(xué)習(xí)記憶的影響，不同的研究結(jié)果不盡相同。本實驗運用行為認(rèn)知學(xué)檢測手段，對3月齡和5月齡健康雌性SD大鼠，卵巢切除去勢后皮下注射孕酮，采用Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化，探討外源性孕酮對去勢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，以期為臨床上醫(yī)源性卵巢去勢后的激素替代及某些疾病如早老性癡呆的治療探索新的治療線索并提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1.動物和分組:實驗動物為3月齡及5月齡，體質(zhì)量為250±20g的健康雌性SD大鼠各60只［浙江大學(xué)實驗動物中心提供，SYXK(浙)2007－0099］。每年齡組隨機(jī)為6組:①正常組;②卵切組;③卵切+孕酮組;④卵切+芝麻油組;⑤假手術(shù)+孕酮組;⑥假手術(shù)+芝麻油組。

2.方法:(1)分組給藥:正常組:不做任何處理;卵切組:切除卵巢，不給予任何治療;卵切+孕酮組:切除卵巢，皮下注射孕酮20mg/kg進(jìn)行治療;卵切+芝麻油組:切除卵巢，皮下注射等體積的無菌芝麻油進(jìn)行治療;假手術(shù)+孕酮組:打開腹腔，不切除卵巢，但是給予皮下注射孕酮20mg/kg進(jìn)行治療;假手術(shù)+芝麻油組:打開腹腔，不切除卵巢，給予皮下注射等體積的無菌芝麻油進(jìn)行治療。以后每7天給藥1次，共4次。(2)Morris水迷宮行為學(xué)檢測:給藥3周后，參照Morris水迷宮，對大鼠進(jìn)行空間記憶的訓(xùn)練和測試［1］。水迷宮為直徑130cm，高50cm的圓形水池，水深30cm，水溫保持在20± 1℃左右，平臺為透明有機(jī)玻璃，實驗過程中周圍環(huán)境條件保持安靜、穩(wěn)定，實驗分為訓(xùn)練期和測試期。第1天進(jìn)行訓(xùn)練，將大鼠沿壁輕放入水中，記錄大鼠的逃避潛伏期:即從大鼠入水到找到水下平臺所需要的時間，若大鼠120s內(nèi)未找到平臺，則引導(dǎo)大鼠找到平臺，逃避潛伏期以120s計。大鼠找到平臺或被引導(dǎo)到平臺上后停留10s。然后擦干放回籠內(nèi)。第2天開始直到第5天進(jìn)行實際的行為學(xué)測驗，以找到平臺所需的時間的平均值(平均潛伏期)和找到平臺的次數(shù)(平臺次數(shù))來表示。

結(jié)果

1.3月齡青年期大鼠:潛伏期是指在規(guī)定的2min內(nèi)，需要多長時間能夠找到平臺。與正常組比較，3月齡青年期大鼠卵巢切除去勢后平均潛伏期明顯延長(P＜0.01);與卵切組及卵切+芝麻油組比較，卵切+孕酮組、假手術(shù)+孕酮組及假手術(shù)+芝麻油組逃避學(xué)習(xí)成績明顯提高(P＜0.01);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績無顯著差異(P＞0.05，表1、圖1)。

表1 3月齡青年期大鼠平均潛伏期

圖1 3月齡青年期大鼠不同組別平均潛伏期比較

2.平臺次數(shù):平臺次數(shù)是指在規(guī)定的2min內(nèi)找到平臺的次數(shù)。與正常組比較，3月齡青年期大鼠卵巢切除去勢后平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01);與卵切組比較卵切+孕酮組、假手術(shù)+孕酮組及假手術(shù)+芝麻油組空間記憶能力稍有改善(P＜0.05);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績無顯著差異(P＞0.05，表2、圖2)。

表2 3月齡青年期大鼠平臺次數(shù)

圖2 3月齡青年期大鼠不同組別平臺次數(shù)比較

3.5 月齡成年期大鼠:(1)平均潛伏期:與正常組比較，5月齡成年期大鼠卵巢切除去勢后平均潛伏期延長(P＜0.05);假手術(shù)+孕酮組學(xué)習(xí)成績明顯優(yōu)于卵切組及卵切+芝麻油組(P＜0.01);與卵切組及卵切+芝麻油組比較卵切+孕酮組學(xué)習(xí)成績無顯著差異(P＞0.05);假手術(shù)+孕酮組與正常組及假手術(shù)+芝麻油組比較學(xué)習(xí)成績亦無顯著差異(P＞0.05，表3、圖3)。(2)平臺次數(shù):與正常組比較，5月齡成年期大鼠卵巢切除去勢后平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01);假手術(shù)+孕酮組學(xué)習(xí)成績優(yōu)于卵切組(P＜0.05，表4、圖4)。

表3 5月齡成年期大鼠平均潛伏期

圖3 5月齡成年期大鼠不同組別平均潛伏期比較

表4 5月齡成年期大鼠平臺次數(shù)

圖4 5月齡成年期大鼠不同組別平臺次數(shù)比較

討論

Morris水迷宮(Morriswatermaze，MWM)是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計的用于研究大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的裝置［2］，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域檢測動物學(xué)習(xí)記憶能力的常用工具，在世界上已經(jīng)得到廣泛地認(rèn)可，是醫(yī)學(xué)院校開展行為學(xué)研究尤其是學(xué)習(xí)與記憶研究的首選經(jīng)典實驗［3］。Morris水迷宮實驗的基礎(chǔ)是，嚙齒類動物在水中有強(qiáng)烈的逃避水環(huán)境的動機(jī)，并以最快、最直接的途徑逃離水環(huán)境。學(xué)會逃避水環(huán)境的過程體現(xiàn)動物的學(xué)習(xí)能力;根據(jù)周圍環(huán)境進(jìn)行空間定位，有目的地游往水中安全的地方(平臺)，體現(xiàn)動物的空間記憶能力。

經(jīng)典的水迷宮試驗分為空間定向航行(place navigation)試驗和空間搜索(spatial probe)試驗兩部分，其中定向航行試驗用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)的能力，以動物潛伏期時間的長短衡量其學(xué)習(xí)能力，潛伏期愈短其學(xué)習(xí)能力愈強(qiáng);而空間搜索試驗用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的能力，以動物站臺區(qū)域停留時間和穿越站臺區(qū)域次數(shù)評價其空間記憶能力，動物穿越站臺區(qū)域次數(shù)愈多則表明其空間記憶能力愈強(qiáng)。本實驗以Morris水迷宮試驗作為動物學(xué)習(xí)記憶能力測試手段，為排除手術(shù)及皮下注射的干擾，將卵切+孕酮組(即切除卵巢，皮下注射孕酮進(jìn)行治療)作為實驗觀察組，將正常組(即不做任何處理)、卵切組(即切除卵巢，不給予任何治療)、卵切+芝麻油組(即切除卵巢，皮下注射等體積的無菌芝麻油)及假手術(shù)+孕酮組(即打開腹腔，不切除卵巢，但給予皮下注射孕酮進(jìn)行治療)和假手術(shù)+芝麻油組(即打開腹腔，不切除卵巢，皮下注射等體積的無菌芝麻油)作為實驗對照組，觀察研究外源性孕酮對去勢大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。實驗發(fā)現(xiàn)卵巢切除去勢對3月齡青年期和5月齡成年期SD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力均是有害的，表現(xiàn)為尋找隱匿平臺的平均潛伏期延長，穿過平臺區(qū)域的次數(shù)減少，提示大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降可能與卵巢切除去勢后雌、孕激素的缺乏有關(guān)。

學(xué)習(xí)記憶與海馬神經(jīng)元突觸可塑性密切相關(guān)，而生殖內(nèi)分泌的狀態(tài)、卵巢缺失以及出現(xiàn)早老性癡呆(AD)相關(guān)的病理學(xué)變化都會調(diào)整卵巢類固醇激素引起的神經(jīng)可塑性。已證實圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女應(yīng)用激素替代治療(HRT)能改善圍絕經(jīng)期癥狀，在詞匯記憶、警覺和推理等方面均有改善，可能減少或延遲AD的發(fā)生。婦女在絕經(jīng)期激素喪失會使認(rèn)知能力退化，使女性的AD患病率明顯高于男性，有研究提示HRT能通過減少癡呆發(fā)病的風(fēng)險來抵消這種AD發(fā)病率的性別差異，改善腦部功能退化，延緩或預(yù)防AD的發(fā)生［4～6］。而近年美國一項大規(guī)模的臨床前瞻性研究報道了令學(xué)者們困惑的結(jié)果:雌孕激素聯(lián)合治療可能會增加婦女患AD的風(fēng)險［7］。雌孕激素聯(lián)合治療對AD患者認(rèn)知能力可能是有損害的，而單用雌激素治療有益于認(rèn)知能力［8～10］。故目前有人主張對女性絕經(jīng)后應(yīng)補充小劑量雌激素，認(rèn)為可以減少腦卒中和老年癡呆的發(fā)病率，對是否同時應(yīng)用孕激素，目前尚有爭議［7，11，12］。

孕酮對女性的生理和病理生理影響已有很多的研究及實際的臨床應(yīng)用，但對神經(jīng)系統(tǒng)作用直至近年方引起關(guān)注。近年的研究表明，孕酮的作用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出生殖功能的范疇，它不僅可在神經(jīng)系統(tǒng)中合成分泌，并且能影響神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的信號分子。在類固醇激素家族中，孕酮作為一種可以在神經(jīng)系統(tǒng)合成并發(fā)揮作用的神經(jīng)活性甾體，其作用機(jī)制正逐漸被國內(nèi)外學(xué)者所研究。盡管孕酮作用機(jī)制尚不很清楚，但對這一傳統(tǒng)類固醇激素有了新的認(rèn)識，而最近不斷的一些新發(fā)現(xiàn)也逐漸引起人們對其在臨床應(yīng)用上的一些新思索［13］。近年來，孕酮對腦、脊髓和周圍神經(jīng)的保護(hù)及損傷后修復(fù)等研究引起了人們極大的興趣。研究發(fā)現(xiàn)孕酮在多種腦損傷動物模型的治療中具有神經(jīng)保護(hù)作用，能改善模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕腦水腫、延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、防止神經(jīng)元的減少和促進(jìn)神經(jīng)髓鞘的合成［7，14，15］。有學(xué)者在實驗動物腦損傷前或后的一段時間，發(fā)現(xiàn)給予動物外源性孕酮治療，能減輕損傷所致的組織學(xué)和行為學(xué)的損害。盡管眾多實驗證實了孕酮對缺血再灌注損傷腦的保護(hù)作用，但也有不一致的結(jié)果，如Murphy等的結(jié)果顯示孕酮加重去卵巢大鼠局灶性腦缺血后紋狀體的損傷程度，而外源性孕酮對去勢造成絕經(jīng)大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力的影響，對空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善有利抑或有害尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。為此，我們將3月齡和5月齡SD大鼠卵巢切除去勢后皮下注射孕酮，采用Morris水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測，觀察孕酮對大鼠行為認(rèn)知能力的影響，實驗觀察到外源性孕酮能改善青年期去勢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使逃避學(xué)習(xí)成績明顯提高，平臺次數(shù)稍有增加，但不能提高成年期去勢大鼠的認(rèn)知能力，提示外源性孕酮對去勢大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與年齡有關(guān)，與Singh等報道一致，可能與孕酮可減少與年齡相關(guān)的神經(jīng)易損性的毒性損傷有關(guān)［7，14］。Anderson等研究發(fā)現(xiàn)不同劑量孕酮對DNA損傷應(yīng)答、細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控、先天的免疫應(yīng)答及血管的重塑等均有不同的反應(yīng)。本實驗中外源性孕酮不能提高成年期去勢大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，是否還與成年期大鼠生殖內(nèi)分泌的狀態(tài)有關(guān):即體內(nèi)已含有一定量的雌孕激素，這樣要達(dá)到孕酮保護(hù)作用的閾值比較高，而使得孕酮的應(yīng)用未達(dá)到適當(dāng)?shù)闹委熁虮Ｗo(hù)劑量有關(guān)?

總之，孕酮在許多方面具有潛在的應(yīng)用價值，且目前國內(nèi)外已有不少有關(guān)臨床應(yīng)用治療各種神經(jīng)損傷的報道。本研究為孕酮安全用于激素替代，并可作為一種臨床治療醫(yī)源性的卵巢去勢引起的學(xué)習(xí)記憶能力的下降，以及有可能用于某些疾病如早老性癡呆的治療探索新的治療線索并提供一定理論基礎(chǔ)。但仍存在一些問題需進(jìn)一步解決，如因經(jīng)費問題未同時觀察外源性孕酮對老年期去勢大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響、治療不同劑量和治療時間窗的選擇以及孕酮發(fā)揮作用的途徑等方面尚需在以后的研究中進(jìn)一步探討。

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