腦外傷大鼠周圍血中Th1/Th2比例變化及機(jī)制探討

屈曉東 荔志云 周 杰 王茂德

許多研究表明顱腦外傷(TBI)會導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)受損而使患者的發(fā)病率和病死率增加。顱腦外傷可引起免疫系統(tǒng)和大腦之間的平衡破壞，從而導(dǎo)致傷后免疫抑制和感染的發(fā)生。常見的感染如肺部感染、尿路感染和傷口感染，顱腦外傷本身作為一個獨(dú)立的危險因素，通過特定的機(jī)制，使患者對感染的易感性顯著增加。感染不僅使患者的預(yù)后不良，也增加了醫(yī)療成本和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以減少腦外傷患者感染的發(fā)生，具有十分重要的意義。因此，探討顱腦外傷后免疫功能損害的機(jī)制可以幫助我們預(yù)防和治療感染并發(fā)癥，并為我們尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

顱腦外傷后對人體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能都有影響，而其對細(xì)胞免疫的功能影響更明顯。大量的研究表明，在顱腦外傷后體內(nèi)的CD4+數(shù)量降低。CD4+T細(xì)胞有兩個主要亞群Th1(主要分泌IL－2和IFN－γ)和Th2(主要分泌IL－4和IL－5)，Th1和Th2的比例變化在許多疾病的不平衡發(fā)揮重要作用，如Th1/Th2降低與哮喘的發(fā)生有關(guān)，Th1/ Th2比例增加可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，而顱腦外傷后機(jī)體Th1/Th2比例如何變化尚未見有報道。那么顱腦外傷后機(jī)體的Th1/Th2細(xì)胞比例是否失衡?變化的相關(guān)機(jī)制是什么?這將是本文努力解決的問題。

材料與方法

1.腦外傷模型的建立:實(shí)驗(yàn)動物選用成年SD大鼠(220～250g)，雌雄各半，均從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心購買。將動物編號后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表，將腦外傷大鼠(TBI組)分為4個亞組，即致傷后1、3、5、10天，每組8只，每個時間點(diǎn)對照組大鼠6只。到相應(yīng)時間點(diǎn)從心臟取血，取血后處死大鼠。大鼠腦損傷模型參照改進(jìn)的Feeney氏自由落體硬膜外撞擊法，各對照組僅做右頂葉顱骨開窗，不致傷，其余操作同腦外傷組。整個造模操作過程嚴(yán)格無菌操作。對照組大鼠共24只，實(shí)驗(yàn)組動物造模共42只，死亡2只，動物造模成功率95.2%。

2.儀器和檢測方法:FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);試劑:免疫熒光單克隆抗體CD3/CD4/CD25+Foxp3(美國Biolegend公司);IL－4和IFN－γ抗體(eBioscience公司)。

3.大鼠周圍血中IFN－γ和IL－4的測定:從大鼠心臟采血2.5ml，室溫下血液自然凝固10～20min，然后2000r/min離心10min，仔細(xì)收集上清，取出血清在－20℃封存，待統(tǒng)一檢測，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。IL－4和IFN－γ水平用ELISA法(eBioscience)測量。IFN－γ檢測的最小濃度為31.3pg/m l(表1);IL－4檢測的最小濃度為1.6pg/ml(表2)。

4.大鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)測定:從大鼠心臟取血2ml，EDTA抗凝。采血后隨即往西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。各試管中加入抗凝全血100μl，分別加入APC anti－rat CD4/PE anti－rat25和同型對照各20μl雙色標(biāo)記單抗試劑，混勻后室溫避光20min，加固定液1ml靜置10min，2000r/min離心5min，棄上清，加打孔液1ml，2000r/min離心5min，棄上清，然后加Alexa Fluor488 anti－rat Foxp3 Flow Kit 5μl，混勻，放置20min，然后加1m l PBS液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測分析。各指標(biāo)的測定按試劑盒說明書操作。數(shù)據(jù)處理使用處理軟件，由電腦自動處理得出結(jié)果(圖1、表3)。

表1 IFN－γ的濃度變化(pg/m l)

表2 IL－4的濃度變化(pg/m l)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞結(jié)果

表3 Treg細(xì)胞數(shù)量測定結(jié)果

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)大鼠生理參數(shù)，體重，神經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠通常在麻醉后6h恢復(fù)意識，而腦外傷組大鼠傷后持續(xù)約12h昏迷，致傷24h后幾乎恢復(fù)正常飲食行為。腦外傷組大鼠左側(cè)肢體偏癱，爬行拖地，尾巴偏向左側(cè)。對照組和腦外傷組大鼠體重在造模前和造模后無顯著差異。

由表1可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中IFN－γ濃度與對照組相比有明顯差異。IFN－γ濃度在傷后從第1天升高，第3天繼續(xù)升高，但與對照組相比這種差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。傷后第5天IFN－γ濃度繼續(xù)升高，并且顱腦外傷組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，直至傷后第10天，這種差異仍顯著存在。

由表2可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中IL－4濃度與對照組相比有明顯差異。IL－4濃度在傷后從第1天降低，第3天繼續(xù)降低，但與對照組相比這種差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。傷后第5天IL－4濃度繼續(xù)降低，并且顱腦外傷組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，直至傷后第10天，這種差異仍顯著存在。

由表3可看出，顱腦外傷組大鼠外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量從傷后第1天開始與對照組比較明顯下降，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，這種變化直至傷后第10天仍持續(xù)存在。而對顱腦外傷各亞組的Treg細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在各顱腦外傷亞組中Treg細(xì)胞數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異。IFN－γ和IL－4之間的對比關(guān)系為，顱腦外傷后大鼠外周血中IFN－γ的濃度逐漸升高，而IL－4的濃度逐漸降低的變化趨勢。對IFN－γ和IL－4進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果為IFN－γ和IL－4的變化呈明顯負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)－0.443)。

討論

本研究中最重要的發(fā)現(xiàn)是，顱腦外傷可引起大鼠外周血中IFN－γ的濃度升高，IL－4的濃度和Treg下降。IFN－γ在腦外傷后第5天明顯升高(P＜0.05)，而IL－4從腦外傷后第5天明顯下降(P＜0.05)，這種下降趨勢持續(xù)到腦外傷后第10天仍然存在。Treg細(xì)胞從腦外傷后第1天開始下降(P＜0.05)，直至腦外傷后第10天仍未恢復(fù)正常。

一般認(rèn)為輔助性CD4+T細(xì)胞分為兩類Th1和Th2［1～3］。通過對Th2細(xì)胞通路的激活模式主要引起白細(xì)胞介素增加，如IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、IL－13，腫瘤壞死因子－α(TNF－α)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM－CSF);而Th1細(xì)胞則主要分泌IL－1、IL－2、IL－12、干擾素－γ(IFN－γ)，腫瘤壞死因子－β(TNF－β)和血小板聚集因子(PAF)，所以Th1主要分泌大量的INF－γ，Th2則主要分泌IL－4［4，5］。因此INF－γ是Th1的標(biāo)志因子，有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，IFN－γ能夠刺激巨噬細(xì)胞和提高細(xì)胞毒性T的活性，誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生，增加MHC分子共刺激信號，刺激CD4+T細(xì)胞向Th1方向分化，而抑制CD4+T細(xì)胞向Th2方向分化［6］。在動物模型中和臨床治療中IFN－γ還有抗病毒作用［7］;IL－4是由Th2細(xì)胞分泌的一種重要的促炎因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，IL－4一直被認(rèn)為是Th2分泌的代表因子［8～10］。因此我們通過測定大鼠外周血中 INF－γ和IL－4的濃度來代表Th1和Th2的量的多少。IL－4和INF－γ作用相互拮抗，從而保持了Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間的動態(tài)平衡，這種抗炎和促炎之間的失衡會導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生，Th1/Th2的失衡取決于Th1/Th2細(xì)胞失衡通路的激活，這兩種途徑往往是相互排斥的，一個起保護(hù)作用，而另一個則促使疾病的發(fā)生［11，12］。IFN－γ的持續(xù)升高，IL－4的進(jìn)行性下降表明顱腦外傷后大鼠外周血中Th1/Th2趨于Th1，而遠(yuǎn)離Th2，這可能就是導(dǎo)致顱腦外傷后免疫抑制的一個原因。有研究表明IFN－γ的水平與顱腦外傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，所以IFN－γ的水平可以預(yù)測顱腦外傷的嚴(yán)重程度。

那么是什么原因?qū)е嘛B腦外傷后血中Th1/Th2比例改變呢?Liesz A等［13］研究發(fā)現(xiàn)主要免疫調(diào)節(jié)因子CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)是主要的腦保護(hù)調(diào)節(jié)因子，在缺血性腦損傷炎癥后針對多種炎癥通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。在Treg細(xì)胞缺失的小鼠腦梗死模型中，TNF－α、INF－γ和IL－1b的表達(dá)明顯升高［13］。Campbell等［14］都表明了Treg細(xì)胞通過Th細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，以維持或恢復(fù)免疫反應(yīng)過程中極化的Th1、Th2和Th17細(xì)胞，以恢復(fù)免疫平衡。因此我們檢測了顱腦外傷后大鼠外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)顱腦外傷組中大鼠外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量與對照組相比明顯減少，并且與Th1/Th2的比例呈明顯的負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)－0.367且P＜0.05)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)Treg數(shù)量減少或功能抑制可以導(dǎo)致一些自身免疫性疾病。因此，Treg細(xì)胞數(shù)量的減少可能是顱腦外傷后血中Th1/Th2比例失衡的原因。在本研究中我們沒有觀察到這些指標(biāo)在顱腦外傷后多長時間才能夠恢復(fù)到正常水平，并且沒有將大鼠分為顱腦外傷輕、中、重組進(jìn)行觀察。但這些問題將在我們后續(xù)研究中進(jìn)一步解決。

總之，我們發(fā)現(xiàn)顱腦外傷可以引起大鼠外周血中IFN－γ水平明顯升高，IL－4表達(dá)下降，Th1/Th2失衡可能是導(dǎo)致顱腦外傷后機(jī)體容易發(fā)生感染的一個原因。而顱腦外傷后血中Treg細(xì)胞的減少可能是導(dǎo)致Th1/Th2比例失衡的一個原因。Allan，S.E.等聲稱Treg細(xì)胞是一個潛在的抗炎細(xì)胞，用Treg細(xì)胞來治療自身免疫性疾病，抑制移植排斥反應(yīng)，促進(jìn)癌癥和慢性感染的免疫反應(yīng)等方面表現(xiàn)出了令人興奮的結(jié)果。James等研究表明通過基因治療增加IL－4的表達(dá)，用以預(yù)防和(或)治療大鼠關(guān)節(jié)液模型的關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、降低促炎因子水平、血管化和骨退行性變等炎性改變，這提示對人類類似的治療可能也是有益的。因此提高顱腦外傷后機(jī)體血中的Treg細(xì)胞數(shù)量，或增加顱腦外傷后機(jī)體血中的IL－4水平，或減少顱腦外傷后機(jī)體血中的IFN－γ濃度可能能夠改善顱腦外傷患者的免疫狀況，預(yù)防和(或)治療顱腦外傷后的感染。因此Treg細(xì)胞在腦外傷后可能有潛在應(yīng)用價值，提高IL－4水平或降低IFN－γ水平可能成為未來治療顱腦外傷的方法。然而在應(yīng)用到臨床上的之前，仍有很多工作要做，但如果成功，可能會改變目前治療顱腦外傷的治療現(xiàn)狀。

重型顱腦損傷患者傷后存在明顯的Th1/Th2平衡偏移，如果我們從整體水平調(diào)節(jié)神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)的平衡，如增加免疫促進(jìn)類激素或減少免疫抑制類激素，用細(xì)胞因子調(diào)理及免疫營養(yǎng)調(diào)節(jié)治療等，就可以改善患者損傷后的Th1/Th2免疫失衡，增強(qiáng)患者機(jī)體抵抗力，降低患者繼發(fā)感染發(fā)生率，提高臨床治愈率。

1 Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW，et al.Two types ofmurine helper T cell clones.Definition according to profiles of lymphokine activities and secretory proteins［J］.The Journal of Immunol，1986，136 (7):2348－2357

2 Del Prete GF，De CarliM，Mastromauro C，etal.Purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis and excretory－secretory antigen(s)of Toxocara canis expand in vitro human T cells with stable and opposite(type 1T helper or type 2 Thelper)profile of cytokine production［J］.JClin Invest，1991，88(1):346－350

3 Umetsu DT，DeKruyff RH.TH1 and TH2 CD4+cells in human allergic diseases［J］.The Journal of Allergy Clinical Immunology，1997，100(1):1－6

4 Navarro－Zorraquino M，Garcl'a－Alvarez F，Mart'lnez－Fern'andez A R，et al.Pharmacological immunomodulation of surgical trauma［J］.Journal of Investigative Surgery，2007，20(5):283－289

5 Kimura M，Tsuruta S，Yoshida T.Unique profile of IL－4 and IFN－γ production by peripheral blood mononuclear cells in infantswith atopicdermatitis［J］.The Jouranl of Allergy and Clinical Immunology，1998，102(2):238－244

6 Jaffe HA，Gao ZC，Mori Y，et al.Selective inhibition of collagen gene expression in fibroblasts by an interferonγtransgene［J］.Experimental Lung Research，1999，25(3):199－215

7 Garg R，Gupta SK，Tripathi P，et al.Leishmania donovani:identification of stimulatory soluble anti－genic proteins using cured human and hamster lymphocytes for their rophylactic potential against visceral leishmaniasis［J］.Vaccine，2006，24(2):2900－2909

8 KopfM，Le GrosG，Bachmann M，etal.Disruption of themurine IL－4 gene blocks Th2 cytokine responses［J］.Nature，1993，362:245－248

9 Kuhn R，Rajewsky K，MullerW.Generation and analysisof interleukin－4 deficientmice［J］.Science，1991，254:707－710

10 Brusselle G，Kips J，JoosG，etal.Allergen induced airway inflammation and bronchial responsiveness in wildtype and interleukin－4－deficientmice［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，1995，12(4):254－259

11 Maher FO，Nolan Y，Lynch MA.Downregulation of IL－4－induced signalling in hippocampus contributes to deficits in LTP in the aged rat［J］.Neurobiology of Aging，2005，26(1):717－728

12 Cox F，Liew FY.T－cell subsets and cytokines in parasitic infections［J］.Immunology Today，1992，13:445－448

13 Liesz A，Suri－Payer E，Veltkamp C，et al.Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke［J］.naturemedcine，2009，15:192－199

14 Campbell DJ，Koch MA.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cells［J］.Nature Reviews Immunology，2011， 11:119－130