蘆丁對(duì)糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

王素琴 湯玲君 王 艷

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)又稱(chēng)糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病致死、致殘的主要原因［1］。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚未完全闡明，目前認(rèn)為主要與機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)、AGES通路、PKC通路、氨基己糖通路、PAPP通路、多元醇通路等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁可通過(guò)抑制AGEs形成、改善鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)、改善血糖平衡、部分翻轉(zhuǎn)損壞心肌功能從而發(fā)揮治療糖尿病的作用［2～6］。本實(shí)驗(yàn)選擇卡托普利(CAP)為陽(yáng)性對(duì)照藥，通過(guò)觀察蘆丁對(duì)早期DN大鼠24h尿白蛋白、尿素氮、肌酐和腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響，以考察蘆丁對(duì)早期DN大鼠的治療作用，并初步探討蘆丁防治DN的可能機(jī)制。

材料與方法

1.材料:(1)動(dòng)物:健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重200± 10g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK(蘇)2011－0024］，實(shí)驗(yàn)前測(cè)大鼠血糖均正常。(2)藥品及試劑:蘆丁(rutin，實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%)、卡托普利(哈藥集團(tuán)三精北方制藥廠，批號(hào):20110203)、鏈脲霉素(streptozotocin，STZ，深圳晶美公司進(jìn)口分裝)、血糖測(cè)試盒(四川邁克科技股份有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào):1105061)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào):20100907)。(3)儀器:752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(蘇州江東精密儀器有限公司);OneTouch UltraⅡ穩(wěn)豪型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司);Olympus－2000全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus);Olympus－DP70圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus)。

2.方法:(1)糖尿病腎病大鼠模型的建立:參考文獻(xiàn)［1］中方法，雄性大鼠80只，隨機(jī)取10只作為正常組，其余大鼠禁食24h后，腹腔一次性注射 STZ 60mg/kg(臨用前溶于0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4)，正常對(duì)照組給予等量0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72h后尾靜脈取血，測(cè)定空腹血糖≥13.88mmol/L者為造模成功。(2)分組及給藥:取造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為5組:DN模型組(DN)、蘆丁低劑量治療組(RL，10mg/kg)、蘆丁中劑量治療組(RM，30mg/kg)、蘆丁高劑量治療組(RH，90mg/kg)、卡托普利對(duì)照組(CAP，10mg/ kg)，每組10只。各組成模當(dāng)日作為實(shí)驗(yàn)第1天，均以1%羧甲基纖維素配成不同濃度的混懸液灌胃給藥，每天1次，正常組、DN模型組均給予同體積的1%羧甲基纖維素。(3)24h尿白蛋白測(cè)定:第12周末將各組大鼠分別放入金屬代謝籠，準(zhǔn)確收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其24h尿白蛋白量。(4)血糖、尿素氮和肌酐測(cè)定:各組大鼠稱(chēng)重、麻醉，腹主動(dòng)脈收集血液標(biāo)本，1500r/min離心15min，分離血漿，采用葡萄糖氧化酶法，以752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)讀數(shù)測(cè)量血糖，Olympus－2000全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿素氮和肌酐。(5)腎臟指數(shù)測(cè)定:各組大鼠處死后，迅速分離兩側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗后稱(chēng)重。腎臟指數(shù)=1000×腎重/體重。(6)腎組織病理觀察:取腎臟組織，4%甲醛溶液固定，常規(guī)水洗、乙醇脫水、石蠟包埋、切片(5μm厚度)，HE染色(石蠟切片脫蠟、進(jìn)水;蘇木素染色20min;充分水洗;0.5%伊紅染液2～3min;稍快蒸餾水洗;脫水、透明，中性樹(shù)膠封片)，光鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)變化。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為有顯著性差異。

結(jié)果

1.蘆丁對(duì)DN大鼠血糖、尿白蛋白、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐的影響:DN組大鼠的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐與正常對(duì)照組相比明顯升高，且皆有顯著性差異(P＜0.01)，表明造模成功。CAP組的上述各項(xiàng)指標(biāo)較DN對(duì)照組明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05，或P＜0.01)。Rutin低劑量治療組與DN組相比空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、BUN和Cr有差異(P＜0.05)。Rutin中高劑量治療組的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、BUN和Cr較DN組有顯著性降低(P＜0.01)，提示中高劑量Rutin對(duì)DN大鼠的空腹血糖、24h尿白蛋白總量、腎臟指數(shù)、尿素氮和肌酐皆有降低作用，而且Rutin對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的降低作用皆呈劑量依賴(lài)性關(guān)系(表1)。

表1 蘆丁對(duì)DN大鼠血糖的影響(±s，n=10)

表1 蘆丁對(duì)DN大鼠血糖的影響(±s，n=10)

與DN組比較，*P＜0.05，有顯著性差異，＊＊P＜0.01，有極顯著性差異

分組 血糖(mmol/L) 尿白蛋白(mg) 腎臟指數(shù) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L).90 67.44±9.21 NS 6.16±2.16＊＊ 8.42±2.23＊＊ 7.88±0.70＊＊ 7.53±1.27＊＊ 37.17±5.71＊＊CAP 15.79±1.70* 22.05±4.60＊＊ 11.34±1.32＊＊ 17.44±3.48＊＊ 44.63±4.50＊＊RL 17.66±2.94* 34.27±6.16* 13.73±1.30* 22.72±2.56* 58.50±4.81* RM 13.92±2.64＊＊ 32.80±3.26＊＊ 12.84±1.10＊＊ 18.78±1.97＊＊ 50.13±7.12＊＊RH 14.11±1.71＊＊ 26.04±5.09＊＊ 11.57±1.32＊＊ 16.74±1.79＊＊ 46.14±6.52 DN 25.80±5.54 51.01±8.73 15.18±3.72 26.69±5＊＊

2.蘆丁對(duì)DN大鼠光鏡下腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響:正常組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)未見(jiàn)增生，毛細(xì)血管無(wú)擠壓現(xiàn)象。模型組:腎皮、髓質(zhì)分界不甚清晰，腎小球彌漫性增大，腎小球毛細(xì)血管充血，腎小囊變窄，腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，系膜增寬，系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，腎間質(zhì)輕度增生，部分出現(xiàn)水腫，偶見(jiàn)間質(zhì)纖維化，未見(jiàn)明顯的腎小球硬化。CAP組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)多正常，部分腎小球輕度增大、毛細(xì)血管稍充血，腎小囊未見(jiàn)明顯變窄，病變腎小球毛細(xì)血管基膜輕度增厚，系膜稍有增寬，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞無(wú)明顯增生，腎小管偶見(jiàn)上皮細(xì)胞水腫，未見(jiàn)腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁大劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界較為清晰，腎小球局灶狀增生、腎小球毛細(xì)血管輕度充血、腎小球毛細(xì)血管基膜增厚、系膜增寬、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞無(wú)明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，未見(jiàn)腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁中劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界清晰，腎小球結(jié)構(gòu)多正常，部分腎小球輕度增大，毛細(xì)血管稍充血，腎小囊未見(jiàn)明顯變窄，病變腎小球毛細(xì)血管基膜輕度增厚，系膜稍有增寬，系膜細(xì)胞和足細(xì)胞無(wú)明顯增生，腎小管偶見(jiàn)上皮細(xì)胞水腫，未見(jiàn)腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化。蘆丁小劑量組:腎皮、髓質(zhì)分界較為清晰，腎小球局灶狀增生，腎小球毛細(xì)血管輕度充血、腎小球毛細(xì)血管基膜增厚、系膜增寬、系膜細(xì)胞增生、足細(xì)胞無(wú)明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，未見(jiàn)腎間質(zhì)增生、炎癥反應(yīng)和纖維化(圖1)。

4.蘆丁糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用的可能機(jī)制: DN的發(fā)生和發(fā)展，高血糖是其始動(dòng)因素，因而調(diào)節(jié)糖代謝紊亂對(duì)于防治DN至關(guān)重要，脂代謝紊亂亦是其發(fā)生中一項(xiàng)獨(dú)立的損傷因素［7］。糖代謝障礙必定伴隨脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝紊亂也影響糖代謝過(guò)程，兩者常?；橐蚬?。血脂成分的變化可能通過(guò)改變腎小球基膜的磷脂成分或通過(guò)糖基化影響基膜，增加腎小球基膜的通透性，引起白蛋白的排出。另一方面血脂可使腎小球壓力升高，并影響血液流變學(xué)指標(biāo)，改變血管阻力，使腎小球呈高濾狀態(tài)，致白蛋白的排出增多［8］。此外DN患者腎小球?yàn)V過(guò)膜上帶負(fù)電荷的硫酸乙酰肝素合成減少，致使腎小球?yàn)V過(guò)膜電荷選擇性屏障受損及濾過(guò)膜孔徑增大，構(gòu)成形成蛋白尿的病理基礎(chǔ)，隨著病程延長(zhǎng)，尿白蛋白增加。尿白蛋白排泄的多少在一定程度上反映了腎小球?yàn)V過(guò)屏障對(duì)血漿蛋白通透能力的高低。蘆丁能抑制 Fenton (芬頓)反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，具有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，可降低體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的現(xiàn)象，使尿白蛋白降低，防治糖尿病腎病［9］。

圖1 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的電鏡圖片(×400)

腎臟肥大與腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)、腎臟血流量(RPF)的升高有密切關(guān)系，腎臟肥大意味著腎小管腫大以及腎臟承受著豐富的血流量［10，11］。腎小球高濾過(guò)、腎臟肥大和基膜增厚是早期糖尿病腎病的特點(diǎn)，進(jìn)一步發(fā)展則細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化，最終致終末期腎功能衰竭。與正常組比較，模型組腎臟肥大指數(shù)明顯升高;與模型組比較，各治療組腎臟肥大指數(shù)均明顯降低。造模各組大鼠腎臟肥大指數(shù)的增加，說(shuō)明DN腎損傷腎臟肥大的存在。各治療組能在一定程度上抑制DN大鼠腎臟肥大，對(duì)大鼠腎臟的肉眼觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)。蘆丁因具有改善微循環(huán)的作用，從而對(duì)DN腎臟肥大有逆轉(zhuǎn)和恢復(fù)的作用，這在DN防治中具有十分重要的意義。

Mogesen建議將DN分為5期［11］。Ⅰ期腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)增高和腎體積增大，腎血流量(RPF)和腎小球毛細(xì)血管灌注及內(nèi)壓增高，此期無(wú)明顯組織病理學(xué)損害;Ⅱ期腎小球結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，基膜增厚和系膜基質(zhì)增多，但尿白蛋白排泄率(UAER)正常，運(yùn)動(dòng)后可出現(xiàn)間歇性蛋白尿;Ⅲ期出現(xiàn)持續(xù)微量白蛋白尿，GFR逐漸下降至正常或接近正常，但基膜增厚和系膜基質(zhì)增加更加明顯，可有小球結(jié)節(jié)型和彌漫型病變以及小動(dòng)脈玻璃樣變，開(kāi)始出現(xiàn)小球荒廢;Ⅳ期出現(xiàn)大量白蛋白尿，GFR開(kāi)始下降，基膜增厚和系膜基質(zhì)增加較前更加明顯，荒廢小球約占1/3，臨床出現(xiàn)進(jìn)行性增加的非選擇性蛋白尿，可伴雙下肢水腫和高血壓，腎功能逐漸減退;Ⅴ期為尿毒癥期，多數(shù)腎單位閉鎖，血尿素氮、肌酐升高，血壓升高。肌酐是肌酸的代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)的生成量是相對(duì)恒定的，且絕大部分由腎小球?yàn)V過(guò)排出體外。尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，主要由腎臟排泄。當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)功能受損時(shí)，血中尿素氮和肌酐含量必將上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較，模型組大鼠尿素氮和肌酐水平明顯升高，說(shuō)明通過(guò)腹腔注射STZ，可造成大鼠腎功能顯著下降。與模型組比較，各治療組尿素氮和肌酐水平明顯下降，說(shuō)明蘆丁可使尿素氮和肌酐的生化指標(biāo)降低，從而保護(hù)受損的腎功能，延緩DN的進(jìn)程。

病理結(jié)果顯示模型組腎皮、髓質(zhì)分界不甚清晰，腎小球彌漫性增大，腎小球毛細(xì)血管充血，腎小囊變窄，腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，系膜增寬，系膜細(xì)胞增生，足細(xì)胞明顯腫脹，部分腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫，管腔變窄，腎間質(zhì)輕度增生，部分出現(xiàn)水腫，提示模型出現(xiàn)DN早期病變。蘆丁對(duì)上述病理改變具有明顯改善作用，提示蘆丁對(duì)DN大鼠模型具有保護(hù)作用。其保護(hù)作用可能與降低DN大鼠模型血糖、減少尿微量白蛋白、降低血尿素氮、肌酐等方面有關(guān)。

結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中，高劑量(90mg/kg)的蘆丁能有效抑制腎臟肥大，改善腎小球組織形態(tài)，對(duì)DN大鼠的血糖、尿白蛋白、尿素氮和肌酐有非常顯著的降低作用，提示蘆丁可以明顯改善DN大鼠的高血糖以及腎臟病變。因此，蘆丁可以減緩DN的進(jìn)程，改善DN的生理、生化指標(biāo)，對(duì)糖尿病腎病大鼠具有保護(hù)作用。綜上所述，蘆丁在DN大鼠的防治方面有著較好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。

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