fgl2參與重癥急性胰腺炎大鼠微血栓形成

葉曉華 陳壇辀 杜 勇 黃智銘 吳金明 吳建勝

重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是腹部外科常見病之一，常可并發(fā)全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MOF)，病死率極高［1］。近年來學者研究認為急性胰腺炎的發(fā)生與胰腺微循環(huán)障礙有密切關(guān)系，它參與了向重癥急性胰腺炎演進的復雜病理生理過程［2］。fgl2凝血酶原酶又稱纖維介素，可直接活化凝血酶原成為凝血酶原酶，從而迅速啟動凝血過程，并參與多種疾病的凝血局部反應［3～5］。本實驗旨在牛璜膽酸鈉誘導大鼠重癥急性胰腺炎模型中，觀察fgl2凝血酶原酶在SAP大鼠胰腺中的表達，探討其在SAP胰腺微血管病變中的作用及機制，為研究微循環(huán)障礙在重癥急性胰腺炎中的作用及導致胰腺功能障礙和組織損傷的病理機制提供新的思路。

材料與方法

1.實驗材料:(1)動物:健康SD雄性大鼠，質(zhì)量200～250g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。(2)主要試劑與儀器:?；悄懰徕c購自Sigma公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;FirststrandcDNAsynthesiskit購自MBI公司;PCRmix試劑盒購自上海達為科生物公司;兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗體購自北京博奧森公司;EnVision試劑購自Dako公司;實時熒光定量 PCR儀及7500SequenceDetectionSystem為ABI公司產(chǎn)品;顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品;全自動生化分析儀為Hitachi公司產(chǎn)品。

2.實驗方法:(1)模型制備及分組:實驗前禁食過夜，自由飲水。將48只大鼠隨機分成兩組:假手術(shù)組(SO)、重癥急性胰腺炎(SAP)組，每組各24只。SAP組大鼠采用4%的牛磺膽酸鈉1ml/kg胰膽管逆行穿刺勻速注射制模。SO組僅翻動

胰腺幾次即關(guān)腹。術(shù)后1、4、8h分批處死大鼠(各時點8只)，留取下腔靜脈血、胰腺標本待測。(2)血清淀粉酶檢測:采用全自動生化分析儀檢測。(3)胰腺組織病理形態(tài)學觀察:胰腺組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色及Masson染色。鏡下觀察胰腺病理改變。隨機觀察100根管壁外徑≤100μm的微血管，并計算陽性血管率。(4)實時定量(real－time) PCR檢測胰腺組織中fgl2表達:采用Trizol法提取總RNA，取4μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計。引物序列:fgl2上游引物:5'－CCTGGAGATTGTGGTTTCGT－3'，下游引物:5'－TACCATGCCTTTCTCCAAGG－3'，擴增片段長153bp;β－actin上游引物: 5'－TGTCACCAACTGGGACGATA－3'，下游引物:5'－GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA－3'，擴增片段長153bp。反應條件: 50℃2min;95℃5min，95℃ 15s，循環(huán)40次。反應完成后，根據(jù)反應曲線計算thresholdcycle(Ct值)并計算目的基因相對表達量，目的基因量 =2－△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct管家基因)對照組。(5)免疫組化染色:使用Envison法進行fgl2免疫組化染色。按Envision試劑盒說明操作。兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗體(1∶100)為一抗。EnVision試劑(HRP－R/M)37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復染。鹽酸乙醇分化，氨水反藍，最后脫水、透明、封片，鏡檢。PBS代替一抗作為陰性對照。各切片在200倍光鏡下隨機選取10個視野采用Image－ProPlus6.0圖像分析軟件測定其平均吸光度值并進行半定量分析。

3.統(tǒng)計學方法:采用SPSS15.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，進行正態(tài)性檢驗和方差齊性分析，采用單因素方差分析進行組間、組內(nèi)差異性檢驗。兩連續(xù)變量關(guān)聯(lián)強度使用Pearson相關(guān)系數(shù)(r)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.血清淀粉酶檢測結(jié)果:SAP組血清淀粉酶較SO組在各時間點均顯著升高(各時點P＜0.01)。SO組各時點間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 各組大鼠術(shù)后各時點血清淀粉酶值(U/L)

2.形態(tài)學觀察結(jié)果:鏡下，SO組1、4、8h各時點胰腺組織形態(tài)未見異常，胰腺小葉清晰;SAP組1h時胰腺間質(zhì)水腫，伴少量炎細胞浸潤;4h后胰腺間質(zhì)水腫，出血，炎細胞浸潤顯著增加;8h時嚴重出血壞死，見大量中性粒細胞和單核細胞浸潤(圖1)。

圖1 各組大鼠術(shù)后HE染色(×200)

Masson染色用于觀察微血栓形成，光鏡下顯示為高亮紅色區(qū)。Masson染色顯示血栓于胰腺微血管內(nèi)皮，說明是由纖維蛋白形成的原位血栓。Masson染色陽性血管率在SAP組中的各時點顯著高于正常組(P＜0.01)且具有增加的趨勢(P＜0.01，表2、圖2)。

表2 各組大鼠術(shù)后各時點胰腺陽性血管率

圖2 各組大鼠術(shù)后Masson染色(×200)

3.fgl2mRNA及蛋白質(zhì)的表達:SAP組大鼠胰腺的fgl2mRNA和胰腺fgl2蛋白質(zhì)表達相比SO組均明顯升高，且隨病程延長逐漸增多(表3)。免疫組化染色顯示，fgl2主要表達在SAP組大鼠胰腺微血管內(nèi)皮細胞(圖3)。

表3 各組大鼠術(shù)后各時點胰腺fgl2mRNA和蛋白表達量

圖3 各組大鼠術(shù)后各時點fgl2免疫組化染色(×200)

4.胰腺fgl2表達與陽性血管率相關(guān)性分析:將SAP組大鼠胰腺組織fgl2凝血酶原酶表達水平與每100根微血管中陽性血管率進行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果顯示SAP組大鼠胰腺內(nèi)fgl2凝血酶原酶表達的平均吸光度值與陽性血管率存在顯著相關(guān)(r= 0.878，P＜0.01)。

討論

急性胰腺炎可引起一系列免疫反應，影響病程發(fā)展及預后。在此進程中，凝血系統(tǒng)的功能也隨之發(fā)生重大變化，其中主要有胰腺的微循環(huán)功能障礙［2］。目前主要認為巨噬細胞、中性粒細胞和內(nèi)皮細胞激活，引起促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)過度釋放是胰腺微循環(huán)障礙發(fā)生的主要機制［6］。微循環(huán)障礙時的低血容量可導致血液的高凝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺內(nèi)原位微血栓形成，提示SAP大鼠胰腺功能障礙及組織損傷與其微循環(huán)功能障礙密切相關(guān)。fgl2凝血酶原酶的促凝途徑與經(jīng)典的內(nèi)外源凝血途徑不同，它可直接激活凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪付龠M凝血，同時fgl2凝血酶原酶接受細胞因子調(diào)控，具有促凝血和炎癥的雙重作用，Levy將fgl2凝血酶原酶的促凝途徑，稱為“免疫凝血”［3，7，8］。有研究報道，fgl2凝血酶原酶高表達于小鼠MHV－3爆發(fā)性肝炎、自發(fā)性流產(chǎn)、器官移植排斥反應等疾病的生理病理過程中［9，10］。它可通過觸發(fā)急性炎癥細胞聚集，在局部組織高表達，啟動局部凝血過程，導致纖維蛋白沉積、微血栓形成、微循環(huán)障礙，最終導致臟器形態(tài)學變化和功能障礙。

本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺本研究結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺中fgl2mRNA相比SO組顯著升高(P＜0.01)，且隨病程延長而逐漸增加(P＜0.01)。推測在胰腺炎病程中，炎癥因子協(xié)同刺激大鼠微血管內(nèi)皮細胞中fgl2凝血酶原酶基因，首先在轉(zhuǎn)錄水平上表達增高，再進一步增加凝血酶原酶合成，然后通過激活凝血系統(tǒng)導致胰腺組織微血管內(nèi)血栓形成，從而促使胰腺壞死發(fā)生。免疫組化結(jié)果顯示SAP大鼠胰腺微血管內(nèi)皮細胞中可見fgl2凝血酶原酶蛋白高表達，且表達水平與微血栓陽性血管率正相關(guān)(r=0.878，P＜0.01)。該結(jié)果提示fgl2凝血酶原酶可能通過介導胰腺內(nèi)微血栓的形成而促進重癥急性胰腺炎的發(fā)生與發(fā)展。

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