現(xiàn)代生物技術(shù)在我國(guó)蘿卜遺傳育種中的應(yīng)用與展望

熊秋芳，張小康，汪志紅，周國(guó)林，李世升

（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430345）

蘿卜（Raphanus sativusL.）為十字花科蘿卜屬一年或二年生雄雌同花的異花授粉作物，在我國(guó)栽培歷史悠久。蘿卜雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯，目前主要利用雄性不育系進(jìn)行制種?，F(xiàn)代蘿卜育種所要改良的目標(biāo)性狀也在不斷的變化，除了對(duì)豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的要求越來(lái)越具體以外，又提出一些新的目標(biāo)，如耐熱、耐抽薹、早熟、晚熟、品質(zhì)優(yōu)、口感佳。

常規(guī)育種方法在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，技術(shù)容易掌握，具有不可低估的潛力，但也往往具有局限性，如育種年限長(zhǎng)?，F(xiàn)代生物技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下發(fā)展起來(lái)的一種高新技術(shù)，從20世紀(jì)70年代開(kāi)始發(fā)展，給動(dòng)植物品種改良帶來(lái)了一場(chǎng)革命。包括基因工程技術(shù)、小孢子培養(yǎng)技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、誘變技術(shù)在內(nèi)的現(xiàn)代生物技術(shù)大大加快了蔬菜遺傳改良的步伐，把育種技術(shù)從宏觀水平提高到微觀水平?，F(xiàn)對(duì)現(xiàn)代生物技術(shù)在我國(guó)蘿卜遺傳育種中的應(yīng)用加以綜述，并對(duì)蘿卜育種中還未涉及到的技術(shù)加以展望，以期為蘿卜遺傳育種及資源創(chuàng)新提供新的思路。

1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)與蘿卜遺傳育種

1.1 小孢子培養(yǎng)技術(shù)

小孢子是指未成熟的單核花粉細(xì)胞。小孢子培養(yǎng)技術(shù)是將小孢子從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)小孢子作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)其細(xì)胞分裂和單倍體胚，進(jìn)而誘導(dǎo)發(fā)育成單倍體植株的過(guò)程。實(shí)踐證明，經(jīng)小孢子培養(yǎng)得到的雙單倍體或DH系株系間的性狀變異幅度大，超親現(xiàn)象和出現(xiàn)特殊優(yōu)良性狀的頻率顯著高于常規(guī)育種，株系內(nèi)性狀整齊，世代間穩(wěn)定性強(qiáng)。通過(guò)小孢子培養(yǎng)出來(lái)的自交系具有高度的純合性，以此配制的雜交組合往往具有更強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。另外小孢子培養(yǎng)所得的胚狀體可以作為理想的轉(zhuǎn)基因受體，用于植物基因工程外源基因?qū)搿?/p>

1.2 蘿卜小孢子培養(yǎng)

蘿卜小孢子培養(yǎng)始于20世紀(jì)80年代，Liehter[1]首次報(bào)道了蘿卜游離小孢子培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出胚狀體。Takahata等[2]對(duì)11份蘿卜材料進(jìn)行了培養(yǎng)，其中有6份獲得了胚狀體，部分獲得了再生植株。張麗[3]以20個(gè)不同類型的蘿卜品種為材料，應(yīng)用大量元素減半的1/2 NLN液體培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，其中1份材料獲了胚狀體。付傳翠等[4]認(rèn)為蘿卜中普遍存在基因型偏性問(wèn)題，在預(yù)處理過(guò)程中保存較高活力是小孢子誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。陳文輝等[5]對(duì)30份夏秋蘿卜進(jìn)行培養(yǎng)，有4份秋蘿卜材料獲得胚狀體，認(rèn)為基因型與誘導(dǎo)率有很大的相關(guān)性，低溫預(yù)處理花蕾可以顯著提高出胚率，33℃高溫?zé)峒ぬ幚?8 h是改變小孢子發(fā)育途徑的重要條件。周志國(guó)等[6]以蘿卜游離小孢子再生植株為試驗(yàn)材料，采用形態(tài)學(xué)觀察、根尖染色體鑒定、流式細(xì)胞測(cè)定等方法進(jìn)行了倍性檢測(cè)。結(jié)果表明，由游離小孢子培養(yǎng)獲得的植株中同時(shí)含有單倍體、雙單倍體和多倍體，來(lái)源不同的小孢子培養(yǎng)獲得的植株倍性比例不同，不同倍性植株具有不同的形態(tài)特征。熊秋芳[7]在1/2 NLN-12培養(yǎng)基中，游離小孢子培養(yǎng)20～25 d后，20個(gè)基因型中有8個(gè)獲得了胚狀體，占供試材料的40%。對(duì)千禧二號(hào)蘿卜雙單倍體植株進(jìn)行親和指數(shù)的測(cè)定，結(jié)果顯示雙單倍體植株蕾期親和指數(shù)均大于5，花期親和指數(shù)均小于0.3，符合自交不親和系的標(biāo)準(zhǔn)，可以作為親本配制雜交組合。

2 原生質(zhì)體融合技術(shù)與蘿卜遺傳育種

2.1 原生質(zhì)體融合技術(shù)

原生質(zhì)體融合，亦稱細(xì)胞融合、體細(xì)胞雜交、超性雜交或超性融合，是指不同種類的原生質(zhì)體不經(jīng)過(guò)有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過(guò)程。原生質(zhì)體融合可避免受精作用中的種的特異性配子識(shí)別反應(yīng)，有可能打破遠(yuǎn)緣雜交中的有性不親和界限。原生質(zhì)體技術(shù)還可用于種質(zhì)資源的保存、細(xì)胞突變體的篩選、細(xì)胞器移植和外源DNA的導(dǎo)入等方面。自從1960年Cocking首次用纖維素酶制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功后，迄今已有46個(gè)科160多個(gè)屬360多種植物的原生質(zhì)體再生植株問(wèn)世，80多種科間、屬間、種間或品種間細(xì)胞融合獲得胞質(zhì)種。近年來(lái)，人們將原生質(zhì)體技術(shù)廣泛應(yīng)用于蔬菜育種工作中，并取得了令人矚目的成果，獲得了甘藍(lán)和白菜、番茄、油菜、蘿卜等體細(xì)胞雜交植株[8]。

2.2 蘿卜原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合是將兩種異源原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑的誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，再經(jīng)過(guò)細(xì)胞壁再生形成雜種細(xì)胞的過(guò)程。雷開(kāi)榮等[9]以甘藍(lán)生產(chǎn)種為受體，以高抗黑腐病、軟腐病及根腫病的蘿卜野生材料為供體，在原生質(zhì)體融合前，用酶或酶+紫外線對(duì)供體原生質(zhì)體進(jìn)行單因素或雙因素復(fù)合處理，以探討不同處理方法對(duì)植株再生的影響。結(jié)果表明，對(duì)供體親本進(jìn)行雙因素復(fù)合處理，實(shí)現(xiàn)了原生質(zhì)體非對(duì)稱性融合并獲得再生植株。孫振久[10]先后探討了不同電融合條件、融合液、原生質(zhì)體密度及不同品種對(duì)甘藍(lán)和蘿卜原生質(zhì)體融合及細(xì)胞分裂的影響，為蘿卜原生質(zhì)體融合技術(shù)的應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)，是成功獲得雜種再生植株的前提。

遠(yuǎn)緣雜交可以有效地進(jìn)行異種、屬間遺傳物質(zhì)的相互引入和轉(zhuǎn)移，有目的地進(jìn)行作物性狀改良，在作物育種上具有廣泛應(yīng)用。蘿卜具有優(yōu)良的抗線蟲(chóng)病基因和細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因，若通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交的方法將蘿卜的優(yōu)良基因?qū)肫渌魑镏?，無(wú)疑對(duì)當(dāng)前作物育種具有重要的意義，同樣我們也可以將別的作物的優(yōu)良基因?qū)胩}卜中來(lái)。人們已獲得了蘿卜蕓薹、蘿卜甘藍(lán)、蘿卜黑芥等新品種[11]，但成功率不高。胡大有等[12]2004年利用3個(gè)甘藍(lán)型油菜品種和1個(gè)黑芥品種與日本櫻島大根蘿卜進(jìn)行正反交，以研究遠(yuǎn)緣雜交的親和性，試驗(yàn)結(jié)果表明，蘿卜與油菜的遠(yuǎn)緣雜交存在嚴(yán)重的生殖障礙。甘彩霞等[13]將蘿卜與大頭菜，張鳳銀等[14]將蘿卜與小白菜進(jìn)行屬間雜交，其后代具體表現(xiàn)為莢果長(zhǎng)到一定程度后黃化，雜種胚胎開(kāi)始敗育。如果采用原生質(zhì)體融合技術(shù)則在一定程度上可克服雜交育種中諸如不親和性、性器官敗育障礙等問(wèn)題。

3 誘變育種技術(shù)與蘿卜遺傳育種

3.1 誘變育種技術(shù)

誘變育種技術(shù)是人為利用物理或化學(xué)因素來(lái)處理種子、植株、組織、細(xì)胞或花粉，使其基因型產(chǎn)生遺傳變異，從中選擇培育新品種的方法。在眾多育種技術(shù)中，誘變育種因其突變頻率較高、突變譜較寬、能有效創(chuàng)造新類型種質(zhì)資源，且突變性狀穩(wěn)定較快，有利于加速新品種選育進(jìn)程等優(yōu)勢(shì)，在作物育種中得到廣泛應(yīng)用，并且取得了極大成功；同時(shí)通過(guò)誘變技術(shù)獲得的一系列新穎突變種質(zhì)資源也是進(jìn)行功能基因研究的重要基礎(chǔ)材料。

誘變育種技術(shù)包括輻射誘變、化學(xué)誘變和航天誘變3種。輻射誘變是指人為地利用物理誘變?cè)矗珉x子束、γ射線、β射線、χ射線、中子等高能射線誘發(fā)作物產(chǎn)生突變，通過(guò)突變體的選擇和鑒定，直接或間接地育成可供生產(chǎn)利用的新品種?；瘜W(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑如甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等烷化劑或堿基類似物等處理植物材料，通過(guò)與核苷酸中的磷酸、嘌呤、嘧啶等分子直接反應(yīng)來(lái)誘發(fā)突變，從而引起植株形態(tài)特征的變異。航天誘變又稱空間誘變，是將供試誘變材料搭乘返回式衛(wèi)星或宇宙飛船，送到距地球200～400 km的太空，利用空間宇宙射線的強(qiáng)輻射，在高真空、微重力和交變磁場(chǎng)等特殊環(huán)境中進(jìn)行誘變處理，使供試材料產(chǎn)生有利變異，返回地面試種后繼續(xù)采用常規(guī)育種技術(shù)，從中選育出農(nóng)作物新品種。航天誘變可以使作物本身染色體產(chǎn)生缺失、重復(fù)、易位、倒置等基因突變。

3.2 蘿卜誘變育種

誘變實(shí)際上是一個(gè)“無(wú)中生有”的技術(shù)，它在創(chuàng)造或改變單基因控制的特殊性狀方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。蔬菜誘變育種始于20世紀(jì)50年代，70年代后期，隨著誘變育種技術(shù)與方法日趨成熟，育成的作物品種逐漸增多。近年來(lái)，我國(guó)科技工作者通過(guò)誘變技術(shù)已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黃瓜等蔬菜新品種。同屬十字花科的油菜誘變育種成績(jī)顯著，單采用60Co-γ射線處理干種子，先后育成了滬油 4號(hào)、111、73-103、秀油 1號(hào)，甘油 5號(hào)等新品種[15]。石淑穩(wěn)等[16]用EMS處理甘藍(lán)型油菜小孢子再生的胚性培養(yǎng)物，獲得長(zhǎng)角果和矮稈突變體。甘藍(lán)型油菜皖油518接受空間誘變后，回收種子SP2代表現(xiàn)出豐富的遺傳變異，其中包括早熟、長(zhǎng)角、多分枝、矮化、黃籽等突變類型。另外，SP2代各株系間產(chǎn)量亦表現(xiàn)出明顯差異，為培育高產(chǎn)油菜新品種創(chuàng)造了豐富的遺傳資源。蘿卜誘變育種在我國(guó)起步較晚，目前只有少量資源經(jīng)衛(wèi)星搭載，如蘇州地方蘿卜良種梅李60天經(jīng)神州一號(hào)搭載，返回地面后經(jīng)多代系統(tǒng)選育，具備了產(chǎn)量高、品質(zhì)好、生長(zhǎng)速度快、抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)。梁秋霞等[17]選取櫻桃蘿卜點(diǎn)點(diǎn)紅為材料，用低能Ar+注入其干種子后的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同劑量的低能Ar+注入都會(huì)使種子發(fā)芽率、成活率及不同階段的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生變異。可以預(yù)見(jiàn)，蘿卜誘變育種具有廣闊的前景。

4 分子標(biāo)記技術(shù)與蘿卜遺傳育種

4.1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記——形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)連鎖；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒別、基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆等方面。

4.2 分子標(biāo)記技術(shù)在蘿卜中的應(yīng)用

據(jù) Vavilov 1923-1931年、Darling-ton 1945年和1955年的調(diào)查認(rèn)為，蘿卜起源于中亞西亞和中國(guó)[18]，世界各地均有種植，歐美主要栽種小型四季蘿卜，亞洲以大型蘿卜為主。中國(guó)栽培蘿卜歷史悠久，蘿卜種質(zhì)資源十分豐富，我國(guó)現(xiàn)已收集保存的蘿卜資源有2 071份，研究這些資源的遺傳背景和關(guān)系是有效利用資源的前提[11]。

分子標(biāo)記在蘿卜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析以及標(biāo)記輔助選擇等方面得到應(yīng)用?？浊锷萚19]用RAPD標(biāo)記對(duì)收集保存的來(lái)源于不同國(guó)家和地區(qū)的代表性栽培蘿卜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行探討性分析，認(rèn)識(shí)其遺傳親緣關(guān)系，為大批量蘿卜種質(zhì)資源的鑒定和分類以及資源的有效利用提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。汪志偉等[20]以蘿卜恢復(fù)系和不育系配制雜交組合，并以174株個(gè)體組成的F2代分離群體作為恢復(fù)基因的標(biāo)記群體。以分離群體的不育株和可育株分別建立不育池和恢復(fù)池，利用100個(gè)RAPD引物對(duì)兩池間的多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，標(biāo)記OPC6 1900與蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因連鎖，可用于對(duì)育性恢復(fù)基因的標(biāo)記輔助選擇。趙麗萍等[21]應(yīng)用SRAP與AFLP兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了蘿卜品種鑒定分析。龔義勤等[22]、宋賢勇等[23]、武創(chuàng)等[24]對(duì)蘿卜基因組 DNA的 RAMPPCR分析體系進(jìn)行優(yōu)化，并初步將體系應(yīng)用于蘿卜品種遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定分析，為蘿卜種質(zhì)資源晚抽薹、CMS恢復(fù)基因、肉質(zhì)根形成等重要性狀標(biāo)記與分子育種提供重要技術(shù)基礎(chǔ)。徐文玲等[25]采用AFLP結(jié)合銀染檢測(cè)技術(shù)，對(duì)與蘿卜耐抽薹基因連鎖的AFLP標(biāo)記進(jìn)行了篩選，結(jié)果以EcoRI-ACT/MseI-CTG和EcoRI-ACG/MseI-CAG兩對(duì)引物組合在抗感池中分別篩選出175 bp和123 bp的兩個(gè)標(biāo)記CTG180和CAG120。譚婷婷等[26]利用蘿卜包含ORF138基因片段的Ogura胞質(zhì)雄性不育（CMS）分子標(biāo)記對(duì)收集的5份蘿卜雄性不育系種子材料進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明有1份種質(zhì)為Ogura雄性不育材料，將Ogura分子標(biāo)記應(yīng)用于蘿卜Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)育工作中，可以提高選擇效率，縮短育種年限。張庶等[27]利用cDNA-AFLP技術(shù)研究了蓮座期的福山包頭大白菜、翹頭青蘿卜及其雜種F1代的葉片，獲得特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄片段（TDF），從而為深入研究大白菜雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)基因和蘿卜-大白菜基因組互作奠定了基礎(chǔ)。

5 基因工程技術(shù)與蘿卜遺傳育種

5.1 基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成基因工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。運(yùn)用基因工程技術(shù)，可以改良植物品質(zhì)，進(jìn)行植物抗蟲(chóng)、抗病、抗寒、抗旱、抗除草劑的研究。

荊贊革等[28]根據(jù)GenBank中擴(kuò)展蛋白序列設(shè)計(jì)特異引物，從蘿卜高代自交系NAU-LVYH06中克隆到一個(gè)擴(kuò)展蛋白基因 RsEXPB1（GenBank accession No.GQ387363，GQ387364），該基因主要在蘿卜生育前期的幼葉、肉質(zhì)根木質(zhì)部和韌皮部中表達(dá)，且表達(dá)豐度可能與該部位細(xì)胞生長(zhǎng)分裂狀態(tài)相關(guān)。潘大云等[29]報(bào)道了將蘿卜抗線蟲(chóng)基因?qū)胗筒说难芯拷Y(jié)果。鄧曉東等[30]進(jìn)行了蘿卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs轉(zhuǎn)化番茄的研究。李文君等[31]發(fā)表了蘿卜葉綠體ATP酶β亞基的cDNA克隆及序列特征的研究結(jié)果。王玲平等[32]以蘿卜品種圓白為材料，根據(jù)白菜CYP450基因CYP86MF保守序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和5'/3'RACE相結(jié)合的方法克隆了一個(gè)CYP450基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)它進(jìn)行了序列分析，為CYP450基因的分離克隆及其在植物發(fā)育代謝中的功能研究提供一定的信息；丁云花等[33]開(kāi)展蘿卜D染色體在7號(hào)連鎖群定位的研究，證實(shí)了定位有抗線蟲(chóng)基因HsIRapls的7號(hào)連鎖群對(duì)應(yīng)于具線蟲(chóng)抗性效應(yīng)的蘿卜D染色體；何啟偉等[34]采用RT-PCR的方法，先后從蘿卜花蕾中克隆了蘿卜花青素調(diào)控基因和開(kāi)花關(guān)鍵基因LFY基因片段，并將后者構(gòu)建了dsRNA抑制雙元表達(dá)載體pPOK-A-I-S-L，轉(zhuǎn)入到蘿卜品種短葉13中，獲得了T0代種子。

6 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)蘿卜種質(zhì)資源豐富，類型和品種繁多，且有多種食用方法。同時(shí)，蘿卜富含淀粉酶、硫代葡萄糖苷、VC、萊菔子素，以及其他維生素和多種礦物質(zhì)，有藥用價(jià)值和保健作用，是頗受歡迎的保健食品。目前，除東亞國(guó)家大面積種植蘿卜外，國(guó)際上其他國(guó)家則只有少量栽培，品種類型也少。因此，調(diào)整和把握好育種目標(biāo)，改進(jìn)和提高育種技術(shù)水平，育成各具特色，優(yōu)質(zhì)、抗病、穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性廣的品種，并繁育出優(yōu)質(zhì)種子，不僅能夠加快國(guó)內(nèi)品種更新，而且完全有條件推向國(guó)際市場(chǎng)。

可以預(yù)見(jiàn)，分子標(biāo)記技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)在蘿卜育種中將有更大的應(yīng)用空間。傳統(tǒng)育種技術(shù)仍是重要的育種手段，現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，必將大大加快蘿卜育種進(jìn)程，創(chuàng)造出更多優(yōu)異的種質(zhì)資源，培育出更多優(yōu)良性狀的蘿卜新品種。例如，采用小孢子培養(yǎng)技術(shù)，加快育種材料的純合過(guò)程，并配合強(qiáng)化室內(nèi)和田間主要經(jīng)濟(jì)性狀的鑒定、選擇，縮短優(yōu)良親本系選育年限。對(duì)耐抽薹性、耐寒性、耐熱性等主要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行分子標(biāo)記研究，輔助常規(guī)親本系及雜種一代的鑒定與選擇，提高選擇的效率和準(zhǔn)確性。運(yùn)用基因工程，轉(zhuǎn)化特異基因，創(chuàng)新蘿卜種質(zhì)，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)、誘變技術(shù)豐富育種材料。

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