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    海帶中巖藻多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

    2012-04-01 07:39:25張文清左萍萍張玉龍
    食品科學(xué) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:巖藻木糖半乳糖

    張文清,左萍萍,徐 辰,楊 蕾,張玉龍,夏 瑋

    (華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

    海帶中巖藻多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

    張文清,左萍萍,徐 辰,楊 蕾,張玉龍,夏 瑋*

    (華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

    通過DEAE-纖維素和凝膠過濾色譜反復(fù)柱層析,采用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)檢測,從提取的海帶巖藻多糖中得到了均一多糖TC-1,并結(jié)合多種分析手段:包括糖組成分析、甲基化分析、紅外光譜(IR)分析等對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。結(jié)果表明:TC-1重均相對分子質(zhì)量(Mw)為3.7×105,主要由巖藻糖構(gòu)成,此外還伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-連接方式存在;木糖以1,3-連接方式存在;甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在;葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在;半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

    海帶;巖藻多糖;分離純化;結(jié)構(gòu)分析

    海帶具有很高的食用、藥用價(jià)值。研究表明,海帶所含的巖藻多糖具有明顯的生理活性,如抗腫瘤、促進(jìn)造血功能等[1-2]。隨著人們對巖藻多糖的深入研究,得知其并非單一結(jié)構(gòu)的化合物,其組成十分復(fù)雜,稱為含巖藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides)。由于巖藻多糖的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素影響[3],目前國內(nèi)外的報(bào)道對其結(jié)構(gòu)組成沒有統(tǒng)一的定義,大多是對其進(jìn)行初步純化[4],得到巖藻多糖的混合物。國外部分學(xué)者對巖藻多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[4-6],但海帶的深度開發(fā)卻涉及較少。本研究利用我國資源豐富的海帶,綜合各種分離手段,得到均一多糖組分,并鑒定了它的一級結(jié)構(gòu),旨在為今后巖藻多糖的開發(fā)利用提供技術(shù)資料和結(jié)構(gòu)信息。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    海帶產(chǎn)自山東威海。

    DEAE-纖維素 美國Whatman公司;Sephacryl S-300、S-200凝膠層析介質(zhì) 美國Pharmacia公司;標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 美國Fluka公司;透析袋(截留相對分子質(zhì)量1000) 上海綠鳥科技公司;纖維素板 上海市藥品檢驗(yàn)所;單糖對照品 美國Sigma公司;無水二甲亞砜、無水硫酸鈉、碘甲烷 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯甲烷 上?;瘜W(xué)試劑有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TL-5.0臺式離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;BT-100恒流泵 上海市滬西分析儀器廠;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器 上海市青浦滬西儀器廠;玻璃層析柱 上海市亞榮生化儀器廠;R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申科機(jī)械研究所;FD1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康儀器有限公司;vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國Sartorius Gmbh公司;Agilent1100高效液相色譜儀、Agilent 6890 5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(色譜柱為HP-5型毛細(xì)管柱) 美國安捷倫有限公司;Nicolet Magna-IR550紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

    1.3 海帶中巖藻多糖的提取[7-8]

    取潔凈干燥的海帶50g,粉碎后用無水乙醇浸泡,脫脂后的固體殘?jiān)盟崛?料液比1:10(m/V),60℃提取2h),提取3次,合并提取液,離心,濃縮上清液至小體積,加入無水乙醇,至所含乙醇的體積分?jǐn)?shù)為3 0%,過濾,上清液再加無水乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為60%,離心收集沉淀,真空干燥得巖藻多糖粗品。

    將巖藻多糖配成5g/100mL的水溶液,用CaCl2對其進(jìn)行初步純化。溶液中加入4mol/L CaCl2,離心后取上清液,加乙醇至其體積分?jǐn)?shù)為65%,用乙醇和丙酮浸洗沉淀,40℃干燥得到巖藻多糖。

    1.4 巖藻多糖的分離純化[9]

    稱取2g巖藻多糖溶于20mL去離子水,經(jīng)DEAE-纖維素柱(1.5cm×50cm)初步分離。依次用去離子水和0.6、1.0、2.0mol/L NaCl溶液洗脫,洗脫流速為2mL/min,采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量,以洗脫體積為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線。將各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當(dāng)體積,對蒸餾水透析,透析袋內(nèi)液冷凍干燥得F-A、F-B、F-C、F-D。用Sephaeryl S-300凝膠層析柱(1.6cm×80cm)進(jìn)一步分離F-C,同時(shí)用苯酚-硫酸法和高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)進(jìn)行檢測,最終得到均一多糖組分TC-1。

    1.5 多糖純度及其相對分子質(zhì)量分布測定

    采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)。樣品及系列標(biāo)準(zhǔn)多糖(不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖:Mw分別為11600、66700、123600、196300、500000)分別流經(jīng)Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)中TSKG 5000PWXL色譜柱,流動(dòng)相為0.1mol/L NaNO3溶液,流速為0.5mL/min,示差折光檢測器檢測。由標(biāo)準(zhǔn)多糖的相對分子質(zhì)量對數(shù)與保留時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及Agilent GPC軟件計(jì)算樣品相對分子質(zhì)量及分布,樣品純度由峰型判斷。

    1.6 單糖組成分析[10]

    取多糖樣品2~3mg置于5mL安瓿瓶中,加2mol/L三氟乙酸(TFA)2mL,封管,120℃水解2h。旋蒸除盡溶液中的TFA,之后加入少量蒸餾水,取5μL進(jìn)行薄層分析。用乙酸乙酯、吡啶、水、乙酸(體積比為5:5:3:1)的混合液展開劑展開后,苯胺-鄰苯二甲酸顯色,所得結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)單糖對照。水解產(chǎn)物另一部分,室溫下加入NaBH4,反應(yīng)2h(間隙振蕩),生成糖醇乙酰酯衍生物,進(jìn)行GC-MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)單糖的糖醇全乙?;苌?制備方法同多糖樣品,但勿需TFA水解)作對照。分析條件:Agilent 6890 5975 GC-MS;色譜柱型號:HP-5色譜柱(30m×0.25mm,0.25μm);分流比20:1;進(jìn)樣量0.2μL;采取程序升溫:初始溫度/停頓時(shí)間為150℃/2min;程序升溫終止溫度/停頓時(shí)間為220℃/10min;升溫速率5℃/min。

    1.7 甲基化分析

    根據(jù)Needs等[11]法對多糖樣品進(jìn)行甲基化,IR檢測產(chǎn)物無羥基特征吸收峰,表明其甲基化完全。將完全甲基化的多糖樣品溶于90%甲酸水溶液,密塞,100℃水浴解聚6h,除盡甲酸后,加入2mol/L TFA,120℃密封水解2h后除去過量TFA。固體殘?jiān)?jīng)NaBH4還原、乙?;频貌糠旨谆陌柕洗家宜狨パ苌?,進(jìn)行GC-MS分析。分析條件:Agilent 6890 5975 GC-MS;色譜柱型號:HP-5色譜柱(30m×0.25mm,0.25μm);分流比3:1;進(jìn)樣量1μL(氯仿為溶劑);采取程序升溫:初始溫度/停頓時(shí)間為120℃/2min;程序升溫終止溫度/停頓時(shí)間250℃/10min;升溫速率5℃/min。

    1.8 紅外光譜(IR)分析及元素分析

    取1~2mg樣品,KBr研磨壓片后進(jìn)行IR分析,甲基化后的樣品采用衰減全反射ATR附件測定IR吸收。采用IR吸收法、vario EL Ⅲ型元素分析儀檢測樣品是否含有硫酸根及硫酸根的含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TC-1的分離純化

    圖1 巖藻多糖的DEAE-纖維素柱色譜分離Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extracted from kelp on DEAE-cellulose column

    如圖1所示,各部分洗脫液分別減壓濃縮至適當(dāng)體積,用蒸餾水透析,透析袋內(nèi)液冷凍干燥所得產(chǎn)物,分別命名為F-A、F-B、F-C、F-D,4個(gè)組分多糖總量分別為35、610、690、18mg。

    多糖的純度不能以通常小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量,因?yàn)槎嗵鞘且环N生物高分子化合物,其存在微觀不均一性。多糖的純度代表是某一多糖的相似鏈長的平均分布。目前通常采用高效液相凝膠過濾色譜法(HPGFC)對多糖進(jìn)行純度檢測。一般來說,在凝膠柱填料的排阻極限內(nèi),HPGFC譜中呈現(xiàn)窄的單一對稱峰的多糖組分可被認(rèn)為是均一多糖。檢測結(jié)果表明,F(xiàn)-A、F-B、F-C、F-D都不純,均需要進(jìn)一步分離純化才能得到均一多糖。本實(shí)驗(yàn)僅對F-C部分作進(jìn)一步分離純化,色譜圖見圖2。

    圖2 F-C的凝膠過濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatogram of F-C

    根據(jù)GPC軟件計(jì)算可知F-C部分可能含有兩種多糖組分,根據(jù)其相對分子質(zhì)量分布,選擇Sephacryl S-300作為凝膠層析介質(zhì)(1.6cm×80cm)進(jìn)行純化。采用苯酚-硫酸法和HPGFC同時(shí)進(jìn)行檢測,得到均一多糖TC-1,其色譜圖見圖3。以已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖制作校正曲線,根據(jù)多糖樣品的保留時(shí)間,由GPC軟件計(jì)算出TC-1的重均相對分子質(zhì)量Mw為3.7×105,數(shù)均相對分子質(zhì)量Mn為3.0×105。

    圖3 TC-1的凝膠過濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatogram of TC-1

    2.2 TC-1的紅外光譜分析

    由圖4可知,3421cm-1處強(qiáng)吸收峰為O-H伸縮振動(dòng)峰;2926cm-1為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰;1645cm-1處為糖環(huán)的伸縮振動(dòng)峰;1258cm-1附近處是由硫酸基S=O伸縮振動(dòng)引起的,證明了TC-1是含有硫酸基取代的多糖;1084cm-1處為C-O的伸縮振動(dòng)峰;848cm-1為C-O-S(直立鍵)的伸縮振動(dòng)峰,硫酸基連接在糖環(huán)的C4位上;此外在1720cm-1附近未檢測到吸收峰,說明不含有糖醛酸;在810cm-1及870cm-1處無吸收,說明可能不含甘露糖[12]。

    圖4 TC-1的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of TC-1

    2.3 TC-1單糖組成分析

    TC-1以2mol/L TFA 120℃水解后的產(chǎn)物進(jìn)行纖維素薄層層析(TLC),以標(biāo)準(zhǔn)單糖為對照,苯胺-鄰苯二甲酸噴霧顯色后顯示有巖藻糖(棕色斑點(diǎn))﹑木糖(紅色斑點(diǎn))、甘露糖(紅色斑點(diǎn))、半乳糖(棕色斑點(diǎn))和葡萄糖(棕色斑點(diǎn))的存在,另外,在Rf值等同于標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸的位置處未發(fā)現(xiàn)紅棕色斑點(diǎn),說明TC-1不含有半乳糖醛酸成分,與上述的紅外結(jié)果一致。

    圖5 TC-1的總離子流圖Fig.5 GC-MS total ion current chromatogram of TC-1

    為證實(shí)TLC的結(jié)果,另取TC-1用2mol/L TFA120℃水解2 h,經(jīng)硼氫化鈉還原,乙酸酐乙?;螅苌镞M(jìn)行GC-MS分析,如圖5所示,通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖相應(yīng)衍生物的保留時(shí)間(圖6)比較,得知TC-1主要含有巖藻糖,伴有少量的木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其物質(zhì)的量比為17.3:1.0:2.6:3.8:5.1。通過IR測定,1240cm-1吸收峰是S=O伸縮振動(dòng)特征吸收峰,830cm-1是C-O-S振動(dòng)的特征頻率[13],元素分析法測得的硫酸基含量為22.4%,印證了巖藻多糖是含有相當(dāng)數(shù)量的巖藻糖(fucose)和硫酸基的多糖[14]。

    圖6 標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of mixed standard monosaccharides

    2.4 TC-1的甲基化分析

    TC-1完全甲基化產(chǎn)物經(jīng)90%甲酸解聚、TFA水解、硼氫化鈉還原及乙?;笾频貌糠旨谆陌柕洗家宜狨パ苌锖筮M(jìn)行GC-MS分析,結(jié)果見表1。

    表1 TC-1甲基化分析結(jié)果Table1 Methylation analysis of reduced TC-1

    由表1可知,巖藻糖殘基存在1,4-、1,3-兩種連接方式,主要以1,3連接方式為主;木糖殘基以1,2-連接方式存在;甘露糖有1,3-、1,6-兩種連接方式;葡萄糖存在1,3,4-、1,2,4、6-兩種連接方式;半乳糖有1,6-、1,3,6-、1,3,4,6- 3種連接方式。

    綜合以上的分析結(jié)果,TC-1為重均相對分子質(zhì)量為3.7×105,硫酸基含量為22.4%,由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的復(fù)雜硫酸酯多糖。其中巖藻糖糖基以1,4-、1,3-的連接方式存在;木糖以1,3-連接方式存在;甘露糖以1,3-、1,6-連接方式存在;葡萄糖以1,3,4-、1,2,4,6-連接方式存在;半乳糖以1,6-、1,3,6-、1,3,4,6-連接方式存在。

    3 討 論

    關(guān)于海帶中巖藻多糖的組成[15]國內(nèi)外已有報(bào)道。程忠玲[13]報(bào)道海帶中提取的褐藻糖膠為一種水溶性雜聚糖,其主要原始成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯,以及少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子。L-巖藻糖-4-硫酸酯的結(jié)構(gòu)特征是1,2-連接的聚α-L-吡喃巖藻糖。主鏈由巖藻糖組成,在巖藻糖上含有大量的硫酸基。李林等[16]研究發(fā)現(xiàn)海帶中的褐藻糖膠是由鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fvc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物,其中單糖的物質(zhì)的量比為Rha:Fuc: Xyl: Man: Gal: Glu=0.41:1.72:3.75:0.96:1:2.17。褐藻糖膠的葡萄糖醛酸、硫酸根及蛋白質(zhì)的含量分別為6.2%、8.7%和4.1%。與這些報(bào)道相比,本實(shí)驗(yàn)從海帶中獲得的TC-1的單糖組成與它們有所不同,為其在生物活性多樣性方面[17]的研究應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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    Isolation, Purification and Structural Analysis of Fucoidan from Kelp

    ZHANG Wen-qing,ZUO Ping-ping,XU Chen,YANG Lei,ZHANG Yu-long,XIA Wei*
    (Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

    A homogeneous polysaccharide named as TC-1 was obtained from kelp by DEAE-cellulose and gel filtration chromatography. Its chemical structure was characterized by means of monosaccharide composition analysis, methylation analysis and IR spectroscopic analysis. TC-1 was a complex sulfated polysaccharide with a weight-average molecular weight of 3.7 × 105. TC-1 mainly consisted of fucose and small amounts of xylose, mannose, glucose and galactose were also found. The chain of TC-1 included 1,4-linked or 1,3-linked fucose, 1,3-linked xylose, 1,3-linked or 1,6-linked mannose, 1,3,4-linked or 1,2, 4,6-linked glucose, and 1,6- linked,1,3,6- linked, or 1,3,4,6- linked galactose.

    kelp;fucoidan;isolation and purification;structural analysis

    O636.1

    A

    1002-6630(2012)01-0068-04

    2011-01-14

    張文清(1969—),女,教授,博士,主要從事天然產(chǎn)物及功能材料的研究。E-mail:zhwqing@ecust.edu.cn

    *通信作者:夏瑋(1976—),女,副教授,博士,主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail:xiawei1999@ecust.edu.cn

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