微RNA與阿爾茨海默病的關(guān)系及應(yīng)用價(jià)值

陳筱山 綜述，晏 勇 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 400016)

微RNA(micro RNA，miRNA)是長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸(nt)的內(nèi)源性非編碼蛋白R(shí)NA基因。在動(dòng)植物細(xì)胞中，通過與靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′端非編碼序列(3′-uncoding region,3′-UTR)相互作用,在翻譯后水平抑制靶基因活性或降解靶基因來調(diào)節(jié)其表達(dá)的活性。miRNA表達(dá)具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，對(duì)神經(jīng)發(fā)育、分化、成熟發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。miRNA功能異常與神經(jīng)變性疾病有密切的關(guān)系。阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是常見的神經(jīng)變性疾病，以記憶功能損害及認(rèn)知功能障礙為主要變現(xiàn)，神經(jīng)元喪失、老年斑(SP)形成和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)為主要特征。研究表明，miRNA功能異常與AD關(guān)系密切，可能作為診斷AD的生物標(biāo)志物及可能的治療靶點(diǎn)，本文就相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA的合成及生物學(xué)特點(diǎn)

1.1miRNA的合成 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類的miRNA超過900個(gè),且這一數(shù)字還在不斷更新。在胞核內(nèi)，大部分miRNA被RNA聚合酶II(RNA polymerase II，RnaseII)轉(zhuǎn)錄形成幾千個(gè)nt，內(nèi)含發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄體(primary transcripts，pri-miRNA)，之后在RNA聚合酶III(RNA polymeraseIII，RnaseIII)Drosha作用下產(chǎn)生約70 nt長(zhǎng)的，包含發(fā)卡樣miRNA前體(pre-miRNA)，在pre-miRNA的3′端有2 nt的懸垂(overhang)結(jié)構(gòu)。懸垂結(jié)構(gòu)被Exportin-5蛋白識(shí)別，轉(zhuǎn)運(yùn)pre-miRNA至胞質(zhì)。在胞質(zhì)中，pre-miRNA被RnaseIII酶Dicer裂解，形成一個(gè)約含21 nt的成熟miRNA和它的衛(wèi)星序列miRNA*的miRNA：miRNA*二倍體，在解旋酶作用下，成熟的miRNA被包含形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)，同時(shí)miRNA*被降解。在RISC和Argonaute(Ago)蛋白作用下miRNA與靶mRNA(target mRNA)結(jié)合。miRNA 5′端的2～8個(gè)殘基被稱為種子序列(seed sequence)，含有與mRNA的3′-UTR的互補(bǔ)序列。根據(jù)miRNA與其目標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)性不同，目標(biāo)mRNA可以被裂解、降解或翻譯抑制。完全的序列互補(bǔ)造成mRNA降解，不完全的序列互補(bǔ)導(dǎo)致翻譯抑制[2]。一種miRNA可以作用于上百個(gè)靶基因，據(jù)此估算，在動(dòng)物中miRNA可以調(diào)節(jié)三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因[3]。根據(jù)miRNA種子序列相似性的不同將miRNA分為不同的家族。不同物種間三分之一的miRNA是高度保守的，在鼠和人成熟miRNA間有大約60%的保守序列被發(fā)現(xiàn)[4]。通過影響多種目標(biāo)轉(zhuǎn)錄體和蛋白的表達(dá)，miRNA在發(fā)育、分化、擴(kuò)增、凋亡和代謝等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用。

1.2miRNA的神經(jīng)生物學(xué)特性 miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布豐富并呈特異性表達(dá)，在腦、神經(jīng)元發(fā)育、分化、神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元特異基因表達(dá)調(diào)節(jié)具有重要作用[4-5]?；蚯谐鼶icer酶導(dǎo)致成熟miRNA缺失，在斑馬魚(zebrafish)Dicer敲除模型中觀察到嚴(yán)重的腦形態(tài)異常。敲除小鼠的Dicer基因可以導(dǎo)致神經(jīng)變性和中腦的多巴胺神經(jīng)元、小腦的Purkinje細(xì)胞以及新皮層神經(jīng)元等神經(jīng)元亞細(xì)胞死亡。在皮層和海馬中Dicer酶的缺失影響細(xì)胞和組織形態(tài)、軸突導(dǎo)向和凋亡[2]。更多研究發(fā)現(xiàn)miRNA干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)過程，參與神經(jīng)干細(xì)胞分化、神經(jīng)突增生和突觸形成。

在秀麗線蟲(C.elegans)，miRNA是保持味覺神經(jīng)元特異性所必需的；在果蠅(Drosophila)中，miRNA維持色覺受體正確分化；在脊椎動(dòng)物中，miRNA則在突觸水平參與突觸可塑性和學(xué)習(xí)等更復(fù)雜的機(jī)制[5-6]。

人腦通過突觸組成復(fù)雜的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，突觸數(shù)量和結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)是記憶產(chǎn)生的基本機(jī)制。新蛋白合成需要某些形式長(zhǎng)時(shí)程記憶的建立，在一些情況下新合成的蛋白來自于神經(jīng)過程內(nèi)局部mRNA的翻譯。一部分mRNA位于樹突桿和棘突上，這些部位有從樹突和興奮性突觸來源、富含小肌動(dòng)蛋白的突起。研究發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)樹突局部mRNA的翻譯控制功能，miRNA參與軸突局部蛋白合成的調(diào)節(jié)。如分布在海馬神經(jīng)元軸突樹突復(fù)合體中的腦特異性miR-134通過抑制Lim區(qū)域包含蛋白激酶-1(Lim-domain-containing protein kinase 1，Limk-1)的翻譯調(diào)節(jié)突觸的可塑性[7]。下調(diào)Limk-1蛋白合成限制樹突棘的生長(zhǎng)，限制興奮性突觸發(fā)育。而當(dāng)神經(jīng)元暴露給腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子后，Limk-1和miR-134的相互作用減低。miR-138是另一種分布于樹突的腦特異性miRNA，通過抑制在軸突和相關(guān)膜控制蛋白棕櫚化狀態(tài)的酶?；鞍琢蝓ッ?1(APT-1)的表達(dá)，負(fù)性調(diào)節(jié)樹突棘的形態(tài)。

研究表明神經(jīng)特異性miRNA在鼠中樞神經(jīng)胚胎發(fā)育和分化中的作用。其中，miRNA-9和miRNA-124與神經(jīng)形成特別相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，它們過度表達(dá)造成星型膠質(zhì)細(xì)胞分化差，而抑制miRNA-9或者抑制二者導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少。在小鼠中，miRNA-9在胚胎期大腦皮層中豐富表達(dá)，在海馬水平參與了Cajal-Retzius細(xì)胞的正確分化，這種分化至少部分通過SATA3磷酸化至TYR705介導(dǎo)[8]。miRNA-124是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)豐富表達(dá)的miRNA之一。在人和鼠中，miRNA編碼的、位于3個(gè)不同染色體上的3個(gè)基因被確認(rèn)。在鼠中，3種基因相伴重疊翻譯。miRNA-124從最初神經(jīng)元前體持續(xù)到最終分化細(xì)胞都可以檢測(cè)到，與RE-1沉默轉(zhuǎn)錄因子(RE-1 silencing transcription factor)相互作用，而RE-1沉默轉(zhuǎn)錄因子具有在神經(jīng)元中抑制神經(jīng)特異性基因的作用。在翻譯后水平，miR-124具有選擇性剪切抑制劑的作用，抑制RNA結(jié)合蛋白PTBR1，從而產(chǎn)生神經(jīng)特異性轉(zhuǎn)錄體。除了促進(jìn)神經(jīng)元特異性基因表達(dá)，Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)在鼠胚胎腫瘤中miR-124參與了神經(jīng)突形成和神經(jīng)元分化。其他如miRNA-125、miRNA-128、miRNA-133、miRNA-388等也與神經(jīng)突增生和神經(jīng)分化有關(guān)[10]。

2 miRNA與AD的關(guān)系

2.1AD的病因 盡管多種分子病變?cè)贏D中被發(fā)現(xiàn)，但AD的病因尚未完全明確，其中，約占AD發(fā)病1%的家族型AD與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor peptide，APP)基因、早老素基因(presenilin，PS)突變有關(guān)，而超過90%的散發(fā)性AD病因不明。散發(fā)性AD與家族性AD病理變化與造成的認(rèn)知功能障礙相似。APP和淀粉樣蛋白(Aβ)代謝異常的“Aβ瀑布學(xué)說”是AD發(fā)病的關(guān)鍵，主要影響海馬和皮層區(qū)域，造成早期的軸突及神經(jīng)元功能障礙、形成由異常聚集的Aβ和主要由tau蛋白組成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)構(gòu)成的Aβ斑塊。AD的發(fā)病還與炎癥、凋亡、細(xì)胞周期異常、線粒體功能障礙、血管因素等多種因素有關(guān)。miRNA可以調(diào)節(jié)Aβ病因相關(guān)的各個(gè)環(huán)節(jié)，如Aβ代謝和炎癥、凋亡等基因都可能做為miRNA作用的靶點(diǎn)，參與并調(diào)節(jié)AD的病理進(jìn)程。

Aβ沉積是老年斑的主要成分，是AD發(fā)病的最主要病理變化之一，Aβ是由APP經(jīng)過淀粉樣物質(zhì)途徑和非淀粉樣物質(zhì)途徑代謝產(chǎn)生。在淀粉樣物質(zhì)途徑中，APP在β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE-1)作用下形成C99，C99做為底物在γ分泌酶作用下形成不溶、有毒性的Aβ，其中Aβ 42最易于形成纖維聚集。其中BACE-1是調(diào)節(jié)Aβ生成的限速酶。因此，miRNA對(duì)與Aβ代謝的APP及BACE-1的mRNA的調(diào)節(jié)成為研究熱點(diǎn)。

2.2miRNA與APP 由于APP在AD發(fā)病中的重要作用，在許多研究中被作為miRNA的靶mRNA。Ryusuke等[11]發(fā)現(xiàn)在秀麗線蟲中，做為APP類似物的apl-1功能在不同發(fā)育階段受到let-7家族mirRNA的基因調(diào)節(jié)。Patel等[12]和Hébert等[13]體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-106a、miR-520c以及miR-106家族的miR-17-p、miR-20a和miR-106b與人類APP相關(guān)。在轉(zhuǎn)染的人類HEK-293細(xì)胞中，miR-106a和miR-520c負(fù)性調(diào)節(jié)包含APP的3′-UTR區(qū)域預(yù)測(cè)靶miRNA序列的基因表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染靶miRNA序列的細(xì)胞相比，在人細(xì)胞株中高表達(dá)的miR-106a和miR-520c降低內(nèi)源性50%的APP水平[12]。在發(fā)育鼠腦和原代神經(jīng)元中，后轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)的miR-20a、miR-17-p和miR-106b與增高的APP水平相關(guān)[13]。Vilardo等[14]在大鼠原代海馬神經(jīng)元中證實(shí)APP水平通過miRNA/RISC途徑被調(diào)節(jié)，沉默Ago2表達(dá)增加APP蛋白水平，運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法，證實(shí)miR-101的反應(yīng)元件(responsive elements，RE)在APP 3′-UTR區(qū)，抑制內(nèi)源性miR-101表達(dá)增加APP水平，而慢病毒方法介導(dǎo)的過度表達(dá)的miR-101則顯著降低海馬神經(jīng)元APP和Aβ水平。而Justin等[15]也證實(shí)給人類Hela細(xì)胞miR-101明顯降低APP水平，而給miR-101的反義抑制劑則出現(xiàn)相反的效果，在阻斷miR-101和APP 3′-UTR的靶mRNA升高APP水平。

miRNA除了對(duì)APP基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)外，還參與了對(duì)神經(jīng)元mRNA的微調(diào)(fine-tuning)即選擇性剪接。有研究表明體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，后有絲分裂神經(jīng)元缺乏miRNA與APP的外顯子7和8的包含有關(guān)，miR-124的異常表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象[16]。在刪除miR-124目標(biāo)基因的內(nèi)源性多聚嘧啶束結(jié)合蛋白1(PTBP1)后可以出現(xiàn)同樣的效果。神經(jīng)特異性的miR-124在AD腦中表達(dá)下調(diào)，說明特殊的miRNA參與了神經(jīng)元的APP選擇性剪接。

2.3miRNA與BACE-1 BACE-1作為Aβ代謝途徑中的限速酶，在Aβ產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用，也成為AD治療研究中關(guān)注的靶點(diǎn)。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-107在AD組中，甚至AD的發(fā)病早期即出現(xiàn)顯著降低。在AD的進(jìn)展過程中，BACE-1 mRNA水平隨著miR-107水平減少而增加。生物信息學(xué)及熒光素酶分析方法證實(shí)miR-107與BACE-1的3′-UTR mRNA序列結(jié)合。Hébert等[18]檢測(cè)了5例散發(fā)性AD患者的前顳葉皮層的miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)包括miR-9、miR-29b、miR-181在內(nèi)的13種miRNA豐富表達(dá)，在鼠腦衰老過程中BACE-1的水平降低，與之相關(guān)的miR-29a、miR-29b1增高。體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的熒光素酶分析證實(shí)miR-29a、miR-29b1與BACE-1的3′-UTR相關(guān)。Bossonneault等[19]在鼠AD模型中發(fā)現(xiàn)BACE-1的蛋白水平與miR-298和miR-328呈負(fù)相關(guān)性，進(jìn)一步運(yùn)用鼠細(xì)胞株也證實(shí)了這些miRNA與BACE-1 mRNA 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。

2.4miRNA與其他靶mRNA 除了BACE-1和APP之外，也有對(duì)神經(jīng)元中其他的功能不明的轉(zhuǎn)錄體的研究。Lukiw等[20]研究了作為炎癥反應(yīng)抑制因子的補(bǔ)體因子H(complement factor H，CFH)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AD患者腦中，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，miR-146a水平上調(diào)而CFH水平下調(diào)，miR-146a與CFH的3′-UTR直接作用。而Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)在APP swe/PS雙轉(zhuǎn)基因AD模型鼠皮層中，miR-34a水平高表達(dá)，進(jìn)一步的序列分析表明miR-34a與Bcl-2的3′-UTR呈反相關(guān)，在SH-SY5Y細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)直接抑制Bcl-2的翻譯，而敲除miR-34a后Bcl-2的水平升高，說明異常的miR-34a通過Bcl-2參與了AD的病理過程。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，利用同樣的雙轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型miR-106b和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體(TGF-βII，TβRII)異常表達(dá)，進(jìn)一步序列分析證實(shí)miR-106b與TβRII的3′-UTR結(jié)合并呈反相關(guān)性，說明異常的miR-106b通過TβRII參與了AD的病理過程。

Shioya等[23]使用實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)在AD患者腦中與神經(jīng)元生長(zhǎng)、引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)的神經(jīng)元導(dǎo)航因子(neurone navigator 3，NAV3)的mRNA水平升高并伴miR-29a水平顯著降低，進(jìn)一步使用熒光素酶分析方法證實(shí)miR-29a下調(diào)NAV3的水平，而在AD患者額葉皮層的錐體神經(jīng)元中NAV3表達(dá)增高，此項(xiàng)研究說明在AD患者腦中，下調(diào)的miR-29a水平可能通過增加NAV3表達(dá)影響神經(jīng)變性進(jìn)程。

3 miRNA在AD中的應(yīng)用

3.1miRNA作為AD診斷的標(biāo)志物 已有研究表明在AD患者死后的腦標(biāo)本中miRNA的異常表達(dá)。而AD患者腦脊液中磷酸化tau蛋白，總tau蛋白升高以及下降的Aβ42可以作為AD診斷的早期生物學(xué)標(biāo)志物[24]。腦中及其體液中相關(guān)表達(dá)異常的miRNA是否可以作為AD診斷的生物學(xué)標(biāo)志物？Hyman等[25]研究發(fā)現(xiàn)與16例正常年老對(duì)照組比較，16例AD患者血單核細(xì)胞miR-34a和miR-181b的表達(dá)顯著增高。Cogswell等[26]的研究表明在AD患者中miRNA不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)異常，而且在其腦脊液中也有異常表達(dá)。在Braak分級(jí)5～6級(jí)的AD患者小腦、海馬和額中溝區(qū)發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-132下調(diào)。在AD腦脊液中miR-146b水平下調(diào)而在腦中豐富的miR-138則在較高的水平表達(dá)。在人單核細(xì)胞中，miR-146a負(fù)性調(diào)節(jié)Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)和激酶信號(hào)途徑，是判斷肺鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后因子，但是它在神經(jīng)細(xì)胞中的作用還不清楚。在大鼠海馬神經(jīng)元中，miR-138負(fù)性調(diào)節(jié)樹突形狀而對(duì)神經(jīng)元非常重要[27]，但是，miR-138的改變是否僅發(fā)生在AD或其他神經(jīng)變性疾病中需要進(jìn)一步的研究。因?yàn)樯窠?jīng)元或者其他神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中miRNA和細(xì)胞外的miRNA的變化及相關(guān)性等尚不明確，因此，還不能將miRNA作為確診AD的生物標(biāo)志物。

3.2miRNA與AD的治療 miRNA在AD中的異常表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)損失及病變，因此，調(diào)節(jié)表達(dá)與疾病相關(guān)的異常miRNA，可以改變疾病的進(jìn)展，使miRNA可能成為治療疾病的潛在靶點(diǎn)。運(yùn)用特殊修飾的反義寡鏈核苷酸即反miRNA可以調(diào)節(jié)在疾病中過高表達(dá)的miRNA[28]。Krützfeldt等[29]報(bào)道化學(xué)合成的寡核苷酸Antagomirs可以在小鼠體內(nèi)沉默特異miRNA。通過靜脈注射Antagomirs后可以對(duì)抗多種miRNA，在肝臟、心臟、肺、腎、肌肉中相應(yīng)的miR-16、miR-122、miR-192和miR-194均明顯降低。在同樣的研究組[30]，體內(nèi)注射時(shí)鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA水平并沒有沉默，而給皮層局部注射后則出現(xiàn)沉默miRNA的效果。除了直接抑制的方法，還有通過下調(diào)miRNA的生物合成的間接的方法。例如四環(huán)素誘導(dǎo)的shRNA被用來下調(diào)miRNA合成過程的關(guān)鍵酶Drosha和Dicer，但是下調(diào)這一途徑可能對(duì)所有miRNA都有作用。另一方面，一些下調(diào)的miRNA促進(jìn)疾病進(jìn)展，如在一些腫瘤中miRNA水平下降，說明這種miRNA可能具有抑制腫瘤作用。這時(shí)可以增加成熟的miRNA至相應(yīng)的組織細(xì)胞中，在這種狀態(tài)下，使用小干擾RNA(siRNA)的合成RNA復(fù)合體，模擬miRNA二倍體從而被RISC復(fù)合體識(shí)別，這種復(fù)合體通過裝載成熟miRNA的序列特征成為內(nèi)源性miRNA[31]。由于穩(wěn)定性及釋放策略等困難這一方法在體內(nèi)的效果仍需進(jìn)一步研究。

4 展 望

由于一種miRNA可以作用于多個(gè)靶RNA，多種miRNA可以作用于同一個(gè)靶RNA，而不同miRNA之間存在相互作用，形成了復(fù)雜的miRNA網(wǎng)絡(luò)。而Schonrock等[32]研究表明，在給鼠海馬神經(jīng)元Aβ42刺激后，神經(jīng)元miRNA水平明顯表達(dá)異常。因此，對(duì)于異常表達(dá)的miRNA是導(dǎo)致AD發(fā)病還是AD病變繼發(fā)的miRNA異常，即如何造成異常miRNA，這一問題目前還不能回答。說明目前miRNA與AD的研究尚處于初步階段，其詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制需要更多的深入研究。但是，隨著高通量miRNA芯片、生物信息學(xué)等技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，越來越多與AD相關(guān)的具有調(diào)節(jié)作用的miRNA及其調(diào)節(jié)機(jī)制會(huì)被發(fā)現(xiàn)，相信會(huì)給AD的早期診斷與治療提供更多新的方法和靶標(biāo)。

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