基于核磁共振的代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用

鄒 云 賀建華謝紅兵 楊永生 江碧波 李江長

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

代謝組學(xué)作為一種高通量、高靈敏度、高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)，目前在各個領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)成為了研究的熱點(diǎn)［1］。后基因組時代的到來驅(qū)動著技術(shù)的不斷進(jìn)步，使細(xì)胞和整個生物體的功能在分子水平上得到探索和發(fā)展。傳統(tǒng)的動物營養(yǎng)研究運(yùn)用化學(xué)分析、消化代謝試驗(yàn)、平衡試驗(yàn)、飼養(yǎng)試驗(yàn)技術(shù)等研究營養(yǎng)物質(zhì)的消化和代謝吸收，這些方法測得的生物學(xué)指標(biāo)比較單一、表觀性強(qiáng)，無法全面反映機(jī)體動態(tài)營養(yǎng)代謝變化。而代謝組學(xué)能測量與生物體有關(guān)的整套低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物、生物體體液或組織的代謝圖譜，可以視為生理或病理狀態(tài)的重要指標(biāo)。這種圖譜對動物細(xì)胞調(diào)控機(jī)制提供了更全面的觀點(diǎn)。因此，代謝組學(xué)日益成為整體性研究動物營養(yǎng)的重要分析技術(shù)。本文簡要綜述了代謝組學(xué)概念、特點(diǎn)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術(shù)及其在動物營養(yǎng)研究中的應(yīng)用。

1 代謝組學(xué)的概念和特點(diǎn)

1.1 代謝組學(xué)概念

在1983年Nicholson首次運(yùn)用NMR技術(shù)對大鼠的全血及血清進(jìn)行了研究，隨后運(yùn)用NMR技術(shù)分析大鼠的尿液［2－3］，并對NMR的技術(shù)提出了展望，于1999年提出了代謝組學(xué)的概念［4］。目前，代謝組學(xué)被大家所接受的2種定義，一種是metabonomics，Nicholson等［4］將其定義為“定量測定病理生理刺激或基因改變情況下生物系統(tǒng)的動態(tài)多參數(shù)代謝物變化”;另外一種是metabolomics，最早出現(xiàn)在Fiehn小組的工作中，主要以研究植物生理代謝網(wǎng)絡(luò)為目的，其分析技術(shù)主要以氣相色譜 － 質(zhì)譜(GC-MS) 為主［5］。Oliver［6］將其定義為“全面、定量分析生物體系中所有代謝物”。前者多以動物的體液和組織為研究對象，應(yīng)用NMR技術(shù)進(jìn)行健康與疾病研究，強(qiáng)調(diào)的是動態(tài)的分析，研究的是生物體在病理生理刺激或基因修飾下其所有代謝物質(zhì)在不同時間的動態(tài)變化規(guī)律。后者多以細(xì)胞為研究對象，主要應(yīng)用GC-MS技術(shù)，強(qiáng)調(diào)的是靜態(tài)的分析，是通過定性和定量地分析生物體所有代謝物的組成來研究生物代謝途徑的一種技術(shù)。如今兩大流派已經(jīng)相互交融，研究手段也涵蓋了NMR、GC-MS和液相色譜－質(zhì)譜等技術(shù)。

1.2 代謝組學(xué)的特點(diǎn)

代謝產(chǎn)物是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果，能直接反映生物體的狀態(tài)，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)分析代謝產(chǎn)物，能全面考察外源性物質(zhì)對生物體產(chǎn)生的整體效應(yīng)，對于闡明機(jī)體復(fù)雜變化具有重要意義。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)具有以下優(yōu)點(diǎn)［7－8］：1)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易;2)代謝組學(xué)的技術(shù)不需建立全基因組測序及大量表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫;3)代謝物的種類遠(yuǎn)小于基因和蛋白質(zhì)的種類;4)代謝產(chǎn)物在各個生物體系中都是類似的，故代謝組學(xué)研究中采用的技術(shù)更通用;5)代謝組學(xué)的研究標(biāo)本容易獲得，而且無需進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理。

2 NMR技術(shù)

代謝組學(xué)研究中常運(yùn)用的技術(shù)有質(zhì)譜、色譜、NMR、紅外光譜、紫外吸收等，目前，NMR技術(shù)已成為代謝組學(xué)的主要研究手段，廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。NMR技術(shù)是基于原子核磁性的一種波譜技術(shù)，利用其原理可以鑒定化合物結(jié)構(gòu)。由Nicholson等［9］提出的基于NMR的代謝組學(xué)研究生物體對外源性物質(zhì)所引起的病理生理反應(yīng)，以及對遺傳變異的應(yīng)答和內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化，通過對生物體液和組織中隨時間改變的代謝物進(jìn)行檢測、定性、定量和分類，將這些代謝信息與病理生理過程中生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來。

基于NMR的代謝組學(xué)最常用的是氫譜，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，NMR的特點(diǎn)是：樣品只需進(jìn)行簡單預(yù)處理甚至不需要處理，樣品用量少，測定時間短，一維譜的測定只需5～10 min，可以同時對所有代謝物進(jìn)行定量分析，定量測定不需要標(biāo)樣;沒有損傷性，不會破壞樣品的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，能夠保持樣品的完整;無偏，是一種非選擇性測定技術(shù)，對所有化合物的靈敏度是一樣的;可以在接近正常生理?xiàng)l件下試驗(yàn)，也可在一定溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇試驗(yàn)條件;可以進(jìn)行實(shí)時動態(tài)檢測，試驗(yàn)方法靈活多樣;1H、13C、15N、31P的NMR譜都可以應(yīng)用于代謝組學(xué)研究，一維核磁共振氫譜(1HNMR)對含氫化合物都有響應(yīng)，因?yàn)?HNMR的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應(yīng)的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關(guān)的譜峰，圖譜中信號的相對強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對含量;操作方法簡單快速，測量精確，重復(fù)性高;測量結(jié)果受樣本大小與外觀色澤的影響較小，且不受操作員的技術(shù)和判斷所影響。因此，NMR方法很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分，通過NMR技術(shù)獲得代謝指紋圖，然后通過模式識別方法，提取有關(guān)代謝組變化的信息，得出相應(yīng)的有價(jià)值的生物學(xué)信息，再對這些生物信息統(tǒng)計(jì)分析和研究，了解機(jī)體生命活動的代謝過程。但NMR也有其缺陷，主要是靈敏度不夠高，不適合分析同一樣品中濃度相差很大的物質(zhì)，動態(tài)檢測范圍也有一定的局限性。

3 基于NMR的代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)研究中的應(yīng)用

隨著后基因時代的到來，技術(shù)的不斷進(jìn)步，動物營養(yǎng)研究也在不斷深入。但仍然面臨著很多問題，盧德勛［10］指出我國動物營養(yǎng)學(xué)面臨的任務(wù)除了繼續(xù)對動物營養(yǎng)需要量和飼料營養(yǎng)價(jià)值評定進(jìn)行深入研究外，還要加強(qiáng)對營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制、宏觀層次的營養(yǎng)信息傳遞機(jī)制、機(jī)體自我營養(yǎng)調(diào)控功能以及環(huán)境包括應(yīng)激對機(jī)體營養(yǎng)代謝和利用的影響和機(jī)制的研究。要解決這些問題，新技術(shù)和新方法就成為了關(guān)鍵，基于NMR的代謝組學(xué)能實(shí)現(xiàn)大量重復(fù)數(shù)據(jù)的采集與分析，為養(yǎng)殖提供新的技術(shù)支持，為動物營養(yǎng)研究提供新思路，為畜牧業(yè)發(fā)展提供新的前景。

3.1 基于NMR的代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)需要量研究中的應(yīng)用

基于NMR的代謝組學(xué)可用于構(gòu)建基于代謝標(biāo)識物的營養(yǎng)需要量評估模型，輔助評價(jià)動物營養(yǎng)需要量。營養(yǎng)素?cái)z入過多或不足都會引起機(jī)體代謝失調(diào)，運(yùn)用基于NMR的代謝組學(xué)分析與常量營養(yǎng)素?cái)z入過多或不足相關(guān)的代謝產(chǎn)物，從而可以確定常量營養(yǎng)素的適宜需要量。Noguch等［11］表明用代謝組學(xué)的方法可以定量測定氨基酸代謝物，可估計(jì)攝入適量的氨基酸與安全范圍，可研究某種代謝產(chǎn)物與攝入過量的蛋白質(zhì)、氨基酸的相關(guān)性，以此確定適量安全的氨基酸攝入量。Matsuzaki等［12］對過量攝入亮氨酸的大鼠血漿代謝組學(xué)分析表明，尿素和α－酮異已酸可能是氨基酸過量攝入時的標(biāo)識物。Toue等［13］通過基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究蛋氨酸代謝的標(biāo)識物，揭示了高半胱氨酸是監(jiān)測蛋氨酸是否過量的良好指標(biāo)。王小雪［14］利用代謝組學(xué)的技術(shù)及思路研究家貓對高蛋白質(zhì)飲食的代謝應(yīng)答，結(jié)果表明NMR研究方法可以用于區(qū)分和評價(jià)高蛋白質(zhì)飲食對家貓機(jī)體代謝的影響，從而為該動物的蛋白質(zhì)需要量提供依據(jù)。He等［15］研究表明，基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)可用于功能、代謝調(diào)節(jié)和氨基酸需要量研究，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)確定飼糧中氨基酸在維持健康和減少疾病的作用方面是非常有前景的。這些試驗(yàn)充分說明利用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)探索動物營養(yǎng)需要量是可行的，相對于常規(guī)方法，代謝組學(xué)有不可替代的優(yōu)勢，今后將更廣泛應(yīng)用于動物營養(yǎng)研究中。

3.2 基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)用于評價(jià)營養(yǎng)物質(zhì)對機(jī)體的影響

基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)不僅可以研究動物營養(yǎng)需要量，在營養(yǎng)物質(zhì)對機(jī)體影響研究中也可發(fā)揮重要作用，主要用于研究營養(yǎng)物質(zhì)引起的內(nèi)源性代謝物的變化，更直接反映體內(nèi)生物化學(xué)過程和狀態(tài)的變化，從而揭示營養(yǎng)物質(zhì)對機(jī)體影響。Solanky等［16］運(yùn)用基于 NMR的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，表兒茶素(EC)使SD大鼠內(nèi)源代謝物水平發(fā)生明顯變化，EC進(jìn)入體內(nèi)影響內(nèi)源性物質(zhì)的代謝途徑，代謝能力降低，碳水化合物代謝水平下降，還可能引起肝臟、腎臟功能改變等。Lamers等［17］用代謝組學(xué)技術(shù)研究了不同劑量的維生素C對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎的作用，收集尿液進(jìn)行NMR分析，結(jié)果表明不同劑量的維生素C對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎的 影 響 有 所 不 同。Martin 等［18］運(yùn) 用 基于1HNMR的代謝組學(xué)方法評估以不同乳制品為主的飼糧對高脂血癥倉鼠早期動脈粥樣硬化的影響，結(jié)果表明，食物環(huán)境可以起到調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的作用。此次試驗(yàn)首次使用代謝組學(xué)方法分析由飼糧不同引起的動脈粥樣硬化，揭示了新的潛在疾病的生物標(biāo)識物。Bertram等［19］利用基于NMR的代謝組學(xué)的方法來探索分別以黑麥或小麥為主的富含纖維的飼糧對高膽固醇血癥豬內(nèi)源性生化效應(yīng)的影響，揭示了高膽固醇血癥豬攝入高纖維黑麥飼糧后，血漿堿含量增加，并找出了評價(jià)血漿堿含量的標(biāo)識物。He等［20］采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對飼糧中添加精氨酸對生長豬的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)增加飼糧中精氨酸添加量能改變機(jī)體脂肪和氨基酸的代謝過程，提高骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)腸道微生物的代謝，顯著提高豬的生長性能。

3.3 基于 NMR的代謝組學(xué)研究動物在不同狀態(tài)下代謝差異和代謝機(jī)制

基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)還可用于特殊狀態(tài)下的代謝差異和代謝機(jī)制研究。Duarte等［21］闡述了利用NMR代謝組學(xué)方法研究哺乳動物細(xì)胞代謝，這些研究包括在細(xì)胞特性(例如耐藥性、細(xì)胞周期的階段、具體的生長條件和遺傳特征)的差異和在不同干擾條件(例如疾病、藥物暴露和照射)下誘發(fā)的變化。Williams等［22］使用1HNMR和高效液相色譜－質(zhì)譜技術(shù)研究老齡化對雄性老鼠尿液中內(nèi)源性代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)標(biāo)識物(包括牛磺酸、肌酐、馬尿酸和相關(guān)的氨基酸/脂肪酸)隨著年齡的增加而增加，而檸檬酸和共振產(chǎn)生葡萄糖/肌醇下降，這些技術(shù)在研究老鼠老齡化和代謝物關(guān)系中發(fā)揮了重要作用。Gao等［23］利用1HNMR方法檢測幽門螺旋桿菌感染的沙鼠，試驗(yàn)結(jié)果顯示幽門螺旋桿菌的感染干擾了碳水化合物的代謝，提高α－葡萄糖、β－葡萄糖和順烏頭酸的含量。除了能量代謝改變，定植于沙鼠胃的幽門螺旋桿菌還造成氨基酸代謝的顯著變化，?；撬岷途彼岷慕?，而動物尿液中的脯氨酸和谷氨酰胺含量的升高。此外，幽門螺旋桿菌感染改變了腸道菌群的一系列微生物相關(guān)的代謝產(chǎn)物，如吲哚酚硫酸鹽和馬尿酸。李民等［24］進(jìn)行了營養(yǎng)不良大鼠血漿小分子物質(zhì)代謝組學(xué)的研究，結(jié)果表明營養(yǎng)不良組大鼠與正常大鼠相比，血漿中肉毒堿和色氨酸含量增加，而甜菜堿、棕櫚酰肉堿、亞麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低，因此代謝組學(xué)可作為營養(yǎng)不良指標(biāo)的篩選方法。Bertram等［25］選取40頭生豬研究了屠宰前的運(yùn)動負(fù)荷對屠宰時血漿代謝物的影響，結(jié)果表明在沒有休息組和對照組之間的血漿代謝圖譜有明顯的差異，這主要可以歸因于屠宰前運(yùn)動增加血漿乳酸含量，屠宰時的血漿代謝物輪廓與屠宰后1 min肌肉溫度、肌肉系水力高度相關(guān)，乳酸被認(rèn)為是聯(lián)系血漿代謝物、pH、溫度和系水力的重要的標(biāo)記物。劉霞等［26］運(yùn)用基于1HNMR代謝組學(xué)方法分析馬兜鈴酸Ⅰ誘導(dǎo)的雌雄小鼠急性腎毒性，揭示馬兜鈴酸導(dǎo)致急性腎毒的分子機(jī)理，即抑制了體內(nèi)三羧酸循環(huán)和能量代謝，破壞了腸道菌群的平衡，引起了腎小管的損傷。Li等［27］通過 NMR技術(shù)研究羊在長期道路運(yùn)輸過程中脂肪酸的代謝變化，揭示了運(yùn)輸動物經(jīng)歷腸道代謝、能量代謝、肌肉代謝的變化，還有可能腎臟應(yīng)答變化，經(jīng)過48 h運(yùn)輸?shù)膭游锉憩F(xiàn)了更強(qiáng)烈的代謝反應(yīng)，并且在72 h后才能恢復(fù)原來代謝軌跡。Zhang等［28］運(yùn)用1HNMR結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行了單側(cè)輸尿管梗阻所致腎間質(zhì)纖維化大鼠的血清樣品的代謝變化研究，結(jié)果表明腎間質(zhì)纖維化組大鼠的代謝圖譜與對照組有很大差異，在單側(cè)輸尿管阻塞大鼠中，一些代謝產(chǎn)物如纈氨酸、異亮氨酸、乳酸、3－羥基丁酸、丙氨酸、醋酸、乙酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸的水平和時間相關(guān)，腎間質(zhì)纖維化大鼠的脂質(zhì)代謝和酮體的合成代謝增強(qiáng)，早期纖維化能量代謝轉(zhuǎn)弱，晚期增強(qiáng)。這些試驗(yàn)充分說明了基于NMR的代謝組學(xué)在研究動物代謝差異和代謝機(jī)制方面發(fā)揮的重要作用。

3.4 基于NMR的代謝組學(xué)在動物食品安全方面的應(yīng)用

動物食品安全關(guān)系著人類的健康，利用NMR的代謝組學(xué)研究獸藥在動物體內(nèi)的殘留。尋找違禁藥相關(guān)的生物標(biāo)志，預(yù)測其殘留效應(yīng)與毒性，將使動物性食品安全的評估工作變得高效而便捷。陳衛(wèi)江等［29］運(yùn)用NMR技術(shù)對豬肉進(jìn)行二維成像，從信號成像的質(zhì)量效果入手，在改變成像參數(shù)的情況下分析圖像變化規(guī)律，將有利于今后對豬肉進(jìn)行NMR成像的質(zhì)量分析的開展，提供了一種研究食品物質(zhì)性質(zhì)的方法，有利于肉制品質(zhì)量的快速定級。Dumas等［30］用代謝組學(xué)方法，以區(qū)分具有不同生理背景(年齡、性別、品種)不同類固醇治療下奶牛尿中的生物標(biāo)記。代謝產(chǎn)物中二甲胺、三甲胺－N－氧化物、馬尿酸、肌酸、肌酐、檸檬酸等在代謝圖譜中具有不同特征。這些尿中生物標(biāo)志物揭示了在氮和能量代謝中的變化。在這項(xiàng)研究中取得的成果，現(xiàn)在可以考慮將代謝組學(xué)方法作為一種輔助方法用來檢測濫用藥物的奶牛。Bertram 等［31］對白肌(PSE)肉和黑干(DFD)肉在凍藏過程中的水分活度和分布的變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，NMR對凍藏誘發(fā)的肉結(jié)構(gòu)變化以及結(jié)構(gòu)變化所產(chǎn)生的水分遷移非常敏感，隨著冷凍時間的增加，豬肉中自由水的含量也明顯增多，揭示運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)可以檢測豬肉品質(zhì)?；贜MR的代謝組學(xué)在動物食品安全中的應(yīng)用，遠(yuǎn)不止以上所列舉，還可以檢測肉的pH、氧化還原作用、乳制品中微生物含量等。

4 小結(jié)

代謝組學(xué)在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用處于起步階段，今后，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)將在動物營養(yǎng)研究中發(fā)揮越來越重要的作用。但是，NMR技術(shù)儀器造價(jià)昂貴，目前在國內(nèi)動物營養(yǎng)領(lǐng)域中還沒有普及，此外復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理也限制了其發(fā)展，因此在今后研究中，要開發(fā)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，加強(qiáng)代謝組學(xué)研究條件的建設(shè)，構(gòu)建動物營養(yǎng)代謝組學(xué)研究體系，集中解決這些問題，為其在動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究提供條件。

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