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    熱療對增強(qiáng)阿霉素治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤敏感性研究

    2013-10-11 01:07:18王向軍
    關(guān)鍵詞:熱療阿霉素膠質(zhì)瘤

    王向軍

    鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州 450014

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤,是起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞多種腫瘤的總稱,其惡性膠質(zhì)瘤在原發(fā)性腫瘤中占35%~45%[1],是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見且最難治療的惡性腫瘤,手術(shù)切除、放療及化療等傳統(tǒng)治療方法能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生一定的治療作用,但在過去的很多年中,神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后及自然發(fā)生、發(fā)展過程并未得到明顯改善,因此開發(fā)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤有效的新方法勢在必行。

    腫瘤熱療(tumor hyperthermia)是近年來快速發(fā)展起來的一類治療癌癥的新方法,基本原理是利用外加的物理能量(如溫?zé)崴?、微波或超聲波等)加熱,使腫瘤組織溫度上升到有效治療溫度,破壞腫瘤細(xì)胞的代謝和結(jié)構(gòu),從而殺滅腫瘤細(xì)胞。目前,腫瘤熱療成為繼手術(shù)、放療、化療和免疫療法之后的第五大療法。阿霉素(adriamycin,ADM)是一種目前臨床常用的廣譜抗癌藥,用于多種腫瘤的治療,具有熱療增敏性和PH敏感性。將熱療與化療聯(lián)合應(yīng)用可對化療起到增效作用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討U251細(xì)胞株對阿霉素的熱療增敏作用。

    1 材料和方法

    1.1主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胎牛血清(四季青公司)、磺酰羅丹明B(sigma公司)、阿霉素(萬樂藥業(yè))、FITC標(biāo)記的P-gp抗體和山羊抗小鼠IgG1(eBioscience公司)、細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。酶標(biāo)儀(DYNEX公司)、流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特有限公司)、UHR-2000高能聚束微波熱療機(jī)(華源醫(yī)療設(shè)備有限公司)、高效液相色譜儀(島津公司)。細(xì)胞培養(yǎng):將U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS)10%、青鏈霉素混合液1%的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2,每2~3d傳代一次。藥物工作濃度確定:阿霉素設(shè)0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL組,每組3個復(fù)孔,SRB法測定細(xì)胞抑制率,以48h的IC50作為工作濃度。

    1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、熱療組、化療組、熱化+療組。以上各組分別給予相應(yīng)的化療和(或)熱療處理:將U251細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105/mL種于6孔板中,化療組和熱化療組中加入工作濃度的阿霉素,熱療組和熱療+化療組細(xì)胞在UHR-2000微波輻射器下進(jìn)行加溫,溫度達(dá)42℃時,維持60min。

    1.3臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞的存活率分別取各組細(xì)胞懸液稀釋,使各組細(xì)胞數(shù)相同,分別吸出0.9mL均勻細(xì)胞液加0.1mL 0.4%的臺盼藍(lán)染色,計(jì)數(shù)3次取均值。細(xì)胞生存率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

    1.4 SRB法測定細(xì)胞增殖率將U251細(xì)胞以每孔5×103個接種到96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)5個復(fù)孔,將各組細(xì)胞分別給予熱療、化療或熱療+化療處理。培養(yǎng)48h后加入50%三氯醋酸50μL,4℃固定1h;超純水洗5遍,風(fēng)干;加0.4%的SRB 50μL,避光染色30min;1%乙酸洗5遍,風(fēng)干,加入10mmol/L Tris堿150μL溶解,酶標(biāo)儀測定吸光度。計(jì)算公式:細(xì)胞存活率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組光吸收值)/對照組光吸收值×100%。

    1.5流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率用PBS洗滌處理48h的細(xì)胞2次,每組(1~5)×105細(xì)胞;加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL Propidium Iodide,混勻;室溫、避光、反應(yīng)5~15min;1h內(nèi),用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡率。

    1.6高效液相色譜法HPLC測定細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度U251細(xì)胞反復(fù)凍融離心,取上清為細(xì)胞內(nèi)液,用HPLCA法測定細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量。測定條件:色譜柱:Agilent 1200E-clipse XDB-C 18柱(4.6mm×150mm,5μm);檢測器:熒光FLD檢測器;流動相:甲醇:0.01mol/mL磷酸二氫鉀:冰乙酸=68∶32∶0.5;流速:1.0mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量40 μL;檢測波長:激發(fā)波長480nm,發(fā)射波長550nm[2]。

    1.7流式細(xì)胞儀測定U251細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)情況取U 251細(xì)胞接種于六孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為2×105個,分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48h收集細(xì)胞,加入100μL破膜劑及5μL Bcl-2/FITC和 Mouse IgG1/FITC,使用流式細(xì)胞儀檢測。

    1.8流式細(xì)胞儀測定U251細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)情況取U251細(xì)胞接種于六孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)2×105個,分組進(jìn)行處理后繼續(xù)培養(yǎng)48h收集細(xì)胞,用PBS洗滌,加入10μL的P-gp/FITC和 Mouse IgG1/FITC,將反應(yīng)物置于37℃冰箱內(nèi)孵育60min,使用流式細(xì)胞儀檢測。

    1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)量資料采用單向方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1阿霉素工作濃度的確定SRB法測得濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μg/mL的阿霉素分別作用于 U251細(xì)胞后,各組抑制率分別為3.22±0.31、9.67±0.95、25.47±2.45、33.89±3.33、57.48±4.01、74.51±4.62、92.64±5.63。U251對阿霉素的IC50為1.45μg/mL,并以此藥物濃度進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。

    2.2細(xì)胞存活率通過以上方法對U251細(xì)胞進(jìn)行處理48 h后,熱療組、化療組、熱療+化療組的存活率均比空白對照組細(xì)胞存活率低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);熱療+化療組的細(xì)胞存活率分別比單純化療組和單純熱療組顯著降低(P<0.01)。見表1。

    2.3細(xì)胞抑制率化療、熱療及熱療+化療組均對U251細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用;同時化療組、熱療組與熱療+化療組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。數(shù)據(jù)見表1。

    2.4阿霉素聯(lián)合熱療對U251細(xì)胞的凋亡作用化療組、熱療組及熱療+化療組細(xì)胞凋亡率分別較對照組明顯升高(P<0.01);同時,熱療+化療組的細(xì)胞凋亡率較熱療組及化療組的凋亡率均明顯升高(P<0.01)。見表1。

    2.5熱療對U251細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響經(jīng)熱療處理后,細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度由(9.03±0.84)pg/mL上升至(36.52±2.97)pg/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明熱療能提高U251細(xì)胞對ADM蓄積的能力。見表1。

    2.6 U251細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)按照試驗(yàn)操作處理48h后,檢測U251細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá)率。結(jié)果顯示:化療組、熱療組及熱療+化療組細(xì)胞中的Bcl-2表達(dá)率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且熱療+化療組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)率分別與熱療組、化療組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

    2.7 U251細(xì)胞中P-gp的表達(dá)按照試驗(yàn)操作處理48h后,檢測U251細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)率。結(jié)果顯示:化療組、熱療組及熱療+化療組細(xì)胞中的P-gp表達(dá)率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且熱療+化療組細(xì)胞P-gp表達(dá)率分別與熱療組、化療組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

    3 討論

    由于腫瘤組織及其周圍血管對溫度的敏感性,利用熱療的方法可有效將其殺滅[3]。近些年,腫瘤熱療受到了人們的廣泛關(guān)注[4-5]。同時,熱療和化療聯(lián)合治療腫瘤具有明顯的增強(qiáng)作用,原因可能是熱療使藥物滲入細(xì)胞量增加、蛋白質(zhì)變性及化療藥物的藥動學(xué)改變等。本研究使用的化療藥物為阿霉素,阿霉素是一種有效的熱療增敏劑,將其與熱療聯(lián)合可以有效增強(qiáng)治療效果[6-7]。

    有文獻(xiàn)報道,熱療殺滅腫瘤細(xì)胞的臨界溫度是42℃,目前臨床上所用的熱療溫度也大都是41~43℃,因此本研究中熱療的處理溫度設(shè)定為42℃。細(xì)胞存活率、細(xì)胞抑制率及細(xì)胞凋亡率的考察結(jié)果顯示,熱療+化療組與單純熱療組、單純化療組及空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);進(jìn)一步測定細(xì)胞內(nèi)ADM的濃度,發(fā)現(xiàn)熱療+化療組的ADM濃度比其他組明顯升高,原因可能是熱療使藥物滲入細(xì)胞量增加,此外熱療能夠降低瘤組織的pH值,ADM在pH值相對較低的情況下會加強(qiáng)釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[8];熱療+化療組細(xì)胞的P-gp蛋白及Bcl-2蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)節(jié)(P<0.01),這說明熱療可能通過降低多藥耐藥蛋白P-gp的表達(dá),使化療藥物的外排下降,細(xì)胞內(nèi)藥物濃度提高,從而增加了U251細(xì)胞對ADM化療的敏感性。同時多數(shù)研究也相繼表明,熱療可有效降低細(xì)胞內(nèi)P-gp的表達(dá)和Bcl-2的表達(dá)[9-10]。

    本研究結(jié)果表明,熱療聯(lián)合化療能增強(qiáng)ADM對U251細(xì)胞的體外抑制作用,提高腫瘤細(xì)胞凋亡率,增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ADM累積量,聯(lián)合熱療可有效下調(diào)P-gp及Bcl-2蛋白的表達(dá)??傮w來說,提高了U251細(xì)胞對阿霉素化療的敏感性。這為神經(jīng)膠體瘤的治療提供了一種新的手段,但此方法仍需更多的實(shí)驗(yàn)支持,為臨床應(yīng)用提供充分的依據(jù)。

    表1 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率、抑制率、凋亡率及熱療對細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響 (s,%)

    表1 U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率、抑制率、凋亡率及熱療對細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的影響 (s,%)

    注:與空白對照組比,*P<0.01;與化療組比,△P<0.01;與熱療組比,○P<0.01

    3 98.72±0.02 - 1.56±0.14 -熱療組 3 50.58±3.54* 45.74±2.36 20.49±1.97* -化療組 3 43.98±3.27* 52.25±4.91 16.33±1.69* 9.03±0.84*熱療+化療組 3 25.95±2.21*△○ 71.37±5.42*△ 45.36±3.97*△○ 36.52±2.97空白對照組*△○

    表2 U251細(xì)胞經(jīng)過熱療、化療及熱療+化療處理后Bcl-2及P-gp表達(dá)的情況 (s)

    表2 U251細(xì)胞經(jīng)過熱療、化療及熱療+化療處理后Bcl-2及P-gp表達(dá)的情況 (s)

    注:與空白對照組比,*P<0.01;與化療組比,△P<0.01;與熱療組比,○P<0.01

    組別 P-gp Bcl-2空白對照組76.5±3.2 74.89±4.5熱療組 53.9±4.9* 59.14±5.0*化療組 50.3±4.6* 65.67±3.8*熱療+化療組 25.2±3.7*△○ 40.52±3.6*△○

    [1]李玉俊 .惡性腦膠質(zhì)瘤組織中NP73的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2010,13(4):17-18.

    [2]Kim D,Lee ES,Park K,et al.Doxorubicin loaded pH-sensitive micelle:antitumoral efficacy against ovarian A2780/DOXR tumor[J].Pharm Res,2008,25:2 074-2 082.

    [3]王洪武 .現(xiàn)代腫瘤靶向治療技術(shù)[M].北京:中國醫(yī)藥出版社,2005:144-145.

    [4]Ito A,Yamaguchi M,Okamoto N,et al.T-cell receptor repertoires of tumor-infiltrating lymphocytes after hyperthermia using functionalized magnetite nanoparticles[J].Nanomedicine(Lond),2012.

    [5]Hofer KG,Mivechi NF.Tumor cell sensitivity to hyperthermia as a function of extracellular and intracellular pH[J].J Natl Cancer Inst,1980,65:621-625.

    [6]Lee H,Kim S,Choi BH,et al.Hyperthermia improves therapeutic efficacy of doxorubicin carried by mesoporous silica nanocontainers in human lung cancer cells[J].Int J Hyperthermia,2011,27:698-707.

    [7]Kim YD,Lees DE,Lake CR,et al.Hyperthermia potentiates doxorubicin-related cardiotoxic effects[J].JAMA,1979,241:1 816-1 817.

    [8]Liu R,He B,Li D,et al.Effects of pH-sensitive chain length on release of doxorubicin from mPEG-b-PH-b-PLLA nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2012,7:4 433-4 446.

    [9]魏紅梅,郭坤元,梅家轉(zhuǎn) .熱療聯(lián)合化療對K562/AO2細(xì)胞體外作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2007,15:724-728.

    [10]韓露周,宋永平 .熱療提高RPM I8226細(xì)胞對阿霉素敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2011,19:680-683.

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