干眼動(dòng)物模型制作的研究進(jìn)展

劉 莉，何慧琴

(南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

目前在對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物作用、環(huán)境因素、改變性激素水平、營(yíng)養(yǎng)因素、摘除淚腺或破壞瞼板腺功能等均可導(dǎo)致干眼癥。干眼動(dòng)物模型主要可分為淚液缺乏型和蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型2種，介紹如下。

1 淚液生成不足型干眼模型

1.1 藥物因素 研究發(fā)現(xiàn)，副交感神經(jīng)興奮可以使淚液分泌增加，如果阻斷神經(jīng)興奮，就可以降低淚液分泌,阿托品是一種常用的副交感神經(jīng)受體阻斷劑。施煒等[1]利用1%阿托品滴眼液，以4次/d的方式給兔點(diǎn)眼，在7 d后兔的淚流量達(dá)到最低點(diǎn)，直到第14天淚流量基本無(wú)明顯異常，角膜染色檢查在11 d內(nèi)角膜熒光素染色增加，但用藥14 d后角膜熒光素染色與用藥前相比，則差異不大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，干眼癥狀表現(xiàn)越不明顯，這種方法不能使觀察對(duì)象長(zhǎng)期維持在一個(gè)理想狀態(tài)，不可用于長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀察。東莨菪堿是從莨菪類(lèi)植物中提取的具有抗膽堿活性的生物堿，與阿托品的中樞作用強(qiáng)的特點(diǎn)不同，氫溴酸東莨菪堿是一種外周作用較強(qiáng)的抗膽堿藥。仇晶晶等[2]在兔的皮下注射氫溴酸東莨菪堿誘導(dǎo)兔淚液分泌減少，給藥后1 h,實(shí)驗(yàn)組淚液分泌量明顯減少，在實(shí)驗(yàn)早期藥物完全代謝之后，發(fā)現(xiàn)淚腺分泌量下降程度有限，持續(xù)給藥的高劑量組第14天出現(xiàn)淚液分泌量明顯下降，并且隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)，淚液分泌量減少更為顯著。結(jié)果提示造模過(guò)程中，淚腺分泌功能的改變與注射藥物的劑量密切相關(guān)，2.0 mg/次,每天注射4次的給藥模式可有效維持氫溴酸東莨菪堿的外周濃度，從而抑制淚腺的分泌，導(dǎo)致干眼的發(fā)生。這種方法在持續(xù)給藥后期，會(huì)出現(xiàn)淚液黏液蛋白膠層的破壞，淚膜穩(wěn)定性下降，在眼表無(wú)法形成完整淚膜，進(jìn)而發(fā)生角膜上皮點(diǎn)狀脫失。這說(shuō)明了皮下注射氫溴酸東莨菪堿引起的干眼以出現(xiàn)的淚流量的減少為主,并且伴有免疫性炎癥和細(xì)胞凋亡影響干眼模型。李晶等[3]使用高滲鹽水分別對(duì)對(duì)照組采用308 mOsmol/L氯化鈉溶液點(diǎn)眼,每日5次，實(shí)驗(yàn)組采用500 mOsmol/L氯化鈉溶液點(diǎn)眼，每日5次，空白組不點(diǎn)眼方式造模，第0天各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第7天起，小鼠出現(xiàn)淚液生成明顯減少(P<0.05),角膜熒光素鈉染色和虎紅染色出現(xiàn)點(diǎn)、片狀著色，角膜熒光素鈉染色評(píng)分升高[3組分別為(0.9±1.2)、(0.5±0.7)、(1.4±1.6)，P<0.01]，淚液蕨類(lèi)圖形減少。第14天起，與空白組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)減少[3組分別為(10.6±2.0)、(11.8±1.3)、(5.4±1.8)，P<0.01]。角膜上皮基底部細(xì)胞排列紊亂缺失，角膜上皮分層減少，出現(xiàn)空泡，角膜上皮層厚度減少[3組分別為(21.69±3.41)、(21.23±2.64)、(15.82±1.38)μm,P<0.05]，角膜上皮細(xì)胞微絨毛丟失。第42天后，Shirmer實(shí)驗(yàn)觀察較第0天下降66%，角膜熒光素染色從第7天起實(shí)驗(yàn)組染色評(píng)分比第0天上升了75%,總體觀察淚液滲透壓升高可以在小鼠眼表引起類(lèi)似于干眼的病理?yè)p害。

1.2 手術(shù)造模 李森等[4]利用水合氯醛將大鼠全身麻醉后,在左耳下方約1 cm處沿皮紋做橫切口，暴露皮下見(jiàn)一微黃色圓形腺體(眶外淚腺)，分離周邊包膜將其完整摘除后縫合，再將左眼外側(cè)1 cm處做縱行切口，暴露皮下見(jiàn)一白色質(zhì)硬膜，切開(kāi)見(jiàn)下方一三角形腺體(眶內(nèi)淚腺)，將其完整摘除后縫合，術(shù)后1周Shirmer試紙濕長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),術(shù)后2周與術(shù)前比較有顯著差異，熒光素染色自術(shù)后2周開(kāi)始較術(shù)前明顯升高，至術(shù)后4周更為明顯穩(wěn)定，說(shuō)明干眼模型制做成功。在目前的實(shí)驗(yàn)研究中，“去勢(shì)”是常見(jiàn)的一種降低性激素的方法，此法主要通過(guò)睪酮水平降低，淚腺上皮細(xì)胞萎縮,杯狀細(xì)胞減少而產(chǎn)生干眼。姚小磊等[5]在造模過(guò)程中，將實(shí)驗(yàn)兔固定后，經(jīng)腹正中切口逐層切開(kāi)進(jìn)入腹腔，切除雙側(cè)卵巢，對(duì)照組不切除卵巢只打開(kāi)腹腔，術(shù)后連續(xù)縫合腹壁各層，45 d后觀察發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組BUT時(shí)間縮短、Shirmer試驗(yàn)減少、淚膜穩(wěn)定性降低以及局部炎性反應(yīng)因子和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)增強(qiáng)、IL-1β與TNF-α大量表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中。這種方法簡(jiǎn)單易行，完全符合干眼癥的病理表現(xiàn)。Zhu等[6]切除一側(cè)淚腺，并在切除的淚腺的上皮細(xì)胞中培養(yǎng)自體外周血淋巴細(xì)胞5 d后，然后把自體外周血淋巴細(xì)胞注入兔的另一側(cè)淚腺中，2周后誘導(dǎo)出類(lèi)似于人類(lèi)Sjogren綜合征的自身免疫干眼癥狀。這說(shuō)明了這些自體外周血淋巴細(xì)胞是起到抗原提呈細(xì)胞作用，其中主要是CD4+T細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)作用，但是這種方法操作復(fù)雜,且對(duì)兩側(cè)淚腺造成嚴(yán)重?fù)p害,不利于自身的對(duì)照。王建倉(cāng)等[7]在實(shí)驗(yàn)中用0.05 kg/L氯胺酮對(duì)12只雄兔進(jìn)行肌肉注射全身麻醉，在雄兔陰囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，先后將雙側(cè)睪丸由腹腔擠入陰囊并捏緊，用消毒刀片將陰囊切一小口，且用力擠出睪丸，結(jié)扎精索靜脈及輸精管，切除睪丸及附睪，連續(xù)縫合后局部涂碘酊預(yù)防感染。術(shù)后8周后,動(dòng)物模型的Schirmer試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間差異性極顯著，第12周后觀察發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型的Schirmer試驗(yàn)、淚膜破裂時(shí)間、虎紅染色檢查均有明顯干眼表現(xiàn)，但由于雄性激素水平的異常極易導(dǎo)致腺泡細(xì)胞表達(dá)自身抗原，引起炎癥反應(yīng)。

1.3 營(yíng)養(yǎng)因素 維生素A的缺乏也可以出現(xiàn)干眼，維生素A中含有視黃酸、視黃醛、視黃醇等活性衍生物,可以維持正常視力和免疫系統(tǒng)。馬軼群等[8]使用以干酪素為主的完全不含VitA的飼料喂干眼病模型組兔子，6個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)組兔子的角膜干燥無(wú)光澤，Schirmer實(shí)驗(yàn)組兔顯示均<10 mm，對(duì)照組兔均>20 mm。淚膜破裂時(shí)間顯示實(shí)驗(yàn)組兔均<12 s，對(duì)照組兔均>24 s，實(shí)驗(yàn)表明，缺少維生素A可導(dǎo)致淚腺腺體萎縮，角膜上皮及結(jié)膜干燥引發(fā)干眼癥。

2 蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼模型

2.1 藥物因素 Jester等[9]通過(guò)每天(約3次)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔局部滴用腎上腺素，持續(xù)半年以上，兔的瞼板腺導(dǎo)管才會(huì)出現(xiàn)角化，導(dǎo)致瞼板腺導(dǎo)管狹窄或閉塞，淚液不能正常排出，從而出現(xiàn)瞼板腺功能障礙。這種造模方式往往需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且成功率較低。黃佳等[10]用1.0 mmol/L的氫氯化鈉溶液燒傷兔結(jié)膜后，其淚液分泌量未見(jiàn)明顯變化，杯狀細(xì)胞密度和黏蛋白含量在28天內(nèi)有明顯差異，淚膜破裂時(shí)間第7天下降明顯,后逐漸延長(zhǎng)，熒光和虎紅染色術(shù)后第1天最明顯，后逐漸下降。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,這種造模方式，癥狀持續(xù)時(shí)間較短，不常用于長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)觀察。

2.2 減少瞬目頻率 劉盛春等[11]在實(shí)驗(yàn)中分別用兩個(gè)鐵夾夾住實(shí)驗(yàn)兔雙眼上眼瞼正中近瞼緣處毛發(fā)，并用絲線相互固定以此控制其瞬目運(yùn)動(dòng)。按同定時(shí)間(由實(shí)驗(yàn)前1 h瞬目次數(shù)的1/3計(jì)算)人為的使各兔瞬目1次，雙眼操作相同，每天8 h(8:00～12:00，14:00～18:00)，其余時(shí)間待其休息進(jìn)食，持續(xù)14 d，室內(nèi)溫度保持在20～23 ℃，相對(duì)濕度保持在40±10%，室內(nèi)無(wú)明顯噪音及氣流干擾。14 d后，比較實(shí)驗(yàn)A組與對(duì)照C組，28天后觀察實(shí)驗(yàn)B組，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)A組7 d和實(shí)驗(yàn)B組3 d淚流量明顯減少,從第3天起，實(shí)驗(yàn)A、B組有大量的角膜熒光染色,BUT時(shí)間縮短，該模型主要通過(guò)減少瞬目頻率，使淚液蒸發(fā)過(guò)多，淚液中黏蛋白缺乏，眼表組織繼而干燥失活，角膜上皮細(xì)胞壞死缺損，由此引起角膜上皮屏障功能的損害而出現(xiàn)干眼的表現(xiàn)。

2.3 破壞瞼板腺功能 Gifford等[12]采用灼燒封閉家兔瞼板腺開(kāi)口,導(dǎo)致瞼板腺口堵塞，脂質(zhì)不能正常排出，引起淚膜脂質(zhì)層異常，從而形成干眼癥。王曉冬等[13]在實(shí)驗(yàn)中，用燒灼器逐個(gè)燒灼模型組上下瞼緣處所有瞼板腺開(kāi)口,每個(gè)開(kāi)口燒灼時(shí)間約2 s燒灼后，摘除兔的第三眼瞼，使淚液蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)，淚膜不穩(wěn)定，無(wú)法對(duì)眼表起到保護(hù)作用。這種方法對(duì)眼表的損害較大，可能造成瞼板腺功能的不可逆性的破壞，而影響治療瞼板腺功能障礙藥物療效的觀察。以上2種方法雖然制作過(guò)程簡(jiǎn)單，但是可能因?yàn)闊频臏囟群兔娣e的大小，而對(duì)眼表組織產(chǎn)生不同程度的損害，影響淚腺的穩(wěn)定性，不利于觀察藥物對(duì)瞼板腺的治療作用。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，干眼癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，且發(fā)病率較高，想要徹底根治比較困難，所以干眼癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究是非常必要的。上述的幾種動(dòng)物模型的制作方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)條件選擇合適的動(dòng)物模型。雖然在制作干眼動(dòng)物模型上有了很大的突破與改進(jìn)，但是在制作過(guò)程中仍存在著許多的不穩(wěn)定因素，急待我們?nèi)ニ伎寂c研究，成功的制作出符合實(shí)驗(yàn)要求的動(dòng)物模型，對(duì)于干眼的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究具有重大意義。

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