副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展

耿萬友，付作寬，周 霞，王學(xué)理，杜立銀

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.科爾沁區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古通遼028042）

副豬嗜血桿菌?。℉aemophilosis parasuis，HPS）是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種泛嗜性細(xì)菌性傳染病，早在1906年由德國學(xué)者Gllisser發(fā)現(xiàn)，故又稱“革拉瑟氏病”（Gllisser＇s disease）［1］。本病以纖維性多漿膜炎、腦膜炎和多關(guān)節(jié)炎為主要特征，并伴有發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)和被毛粗亂等癥狀。Hps主要侵害仔豬尤其是早期斷奶仔豬，4周齡～8周齡的豬對Hps也較敏感，本病的發(fā)病率一般在10%～20%，病死率有時可高達(dá)50%。

本病呈世界性分布，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有38.9%～77.8%的豬攜帶潛在的致病菌［2］。我國也從規(guī)?；B(yǎng)豬場中分離到了該病原菌。Hps感染已經(jīng)成為早期斷奶仔豬和高度健康豬群的威脅，嚴(yán)重的影響了地區(qū)及世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，現(xiàn)將近幾年關(guān)于副豬嗜血桿菌病的研究進(jìn)展闡述如下。

1 病原學(xué)

副豬嗜血桿菌（Hps）是革蘭陰性、非溶血NAD依賴性短小桿菌，屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中的成員。在顯微鏡下Hps呈球形、棒狀或絲狀，無鞭毛、芽胞，通?？梢娗v膜，美藍(lán)染色呈兩極著色。Hps對pH變化和熱應(yīng)激都非常敏感。Hps生長緩慢，而且對于營養(yǎng)物質(zhì)的需求也特別挑剔，有時需要加入特定的X、V等生長因子，這些條件就使得對Hps感染樣本的采集、恢復(fù)以及運(yùn)輸造成很大的困難。一般使用巧克力瓊脂板，在溫度為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，最適pH為7.6～7.8。Hps對外界環(huán)境的抵抗力不強(qiáng)，干燥環(huán)境可使其死亡，一般在60℃經(jīng)5min～20min內(nèi)死亡，常用的消毒藥物也可將其殺死，4℃下可存活7d～10d［3］。

根據(jù)表性特征和致病能力，應(yīng)用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法可將副豬嗜血桿菌分為15個標(biāo)準(zhǔn)血清型，但是由于有限的分辨率和不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比較的困難，仍然有一部分臨床分離菌株不能用血清學(xué)方法分類定型，這就表明還存在其他血清型的可能［4］。同時由于未定型的菌株和標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株毒力多變性的存在，使血清型分類方法也存在一定的局限性。但是值得注意的是必須有效控制地區(qū)流行的血清型，因?yàn)椴煌逍蜕踔潦峭谎逍筒煌曛g的致病力、疫苗的交叉保護(hù)以及預(yù)防治療都存在很大的差異，比如血清型2菌株Bakos A9，血清型14菌株H792和血清型4菌株9904108是沒有致病力的，但血清型2菌株SW124和血清型4菌株SW140與腹腔接種相比，鼻內(nèi)接種以后，可以起到保護(hù)治療的作用。相反，無毒性的血清型7和11能從感染Hps的豬的鼻液中分離得到，而且用血清型7菌株373／03A鼻內(nèi)接種，可使1／6的豬復(fù)發(fā)［2］。

有許多分子生物學(xué)方法應(yīng)用到Hps的血清型分類中，如限制性核酸內(nèi)切酶圖譜法、雙酶切電泳法 、重復(fù)基因共有序列PCR、外膜蛋白圖譜等，Del Rio M L等［5］在對比應(yīng)用協(xié)同凝集試驗(yàn)（CA）和間接血凝試驗(yàn)（HIA）檢測各種臨床分離株血清型的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HIA在敏感性和特異性上都是一種很可靠的Hps分型方法。但也有人認(rèn)為有些分離株因?yàn)樘貏e難生長或者生長緩慢而不能從鼻拭子中得到，比如血清型12，也有一些是因?yàn)楫愒葱缘拇嬖诮o臨床分類帶來了困難［6］。Hps從強(qiáng)毒株到無毒株都有分布，現(xiàn)在15種血清型中最流行是4型和5型，其次是13、14和12型。1、5、10型毒力最強(qiáng)，8型和15型為中等毒力，認(rèn)為3型和6型與臨床癥狀無關(guān)。但是到目前為止，毒力的分子基礎(chǔ)還未確立，血清學(xué)、吞噬抑制和內(nèi)皮細(xì)胞的入侵可能都與Hps的毒力有關(guān)［7］。

2 流行病學(xué)

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道共生菌，也是早期寄生在小豬鼻液中的細(xì)菌之一，可以通過拭子從感染Hps豬的鼻腔、扁桃體和氣管中分離得到。但是為了能夠分離到致病性的Hps以及對分離到的Hps進(jìn)行分類定型，一般建議不使用拭子，因?yàn)檫@樣常常會分離到非致病性的Hps，一般都從病死豬尸體的心臟、肺臟和腦等組織或腹腔液、腦室液、心包液及關(guān)節(jié)液中分離致病菌［8］。病豬和攜帶致病菌的豬是主要的傳染源。本病主要通過空氣經(jīng)呼吸道傳播，病原也可以經(jīng)過排泄物、分泌物等污染飼料和飲水。有人發(fā)現(xiàn)經(jīng)產(chǎn)母豬的胎衣等分泌物中Hps的含量要比初產(chǎn)母豬高出許多［9］。另外，生長環(huán)境的惡劣、營養(yǎng)不良、天氣的突變、不同日齡豬的混養(yǎng)、提前斷奶、轉(zhuǎn)群以及運(yùn)輸?shù)雀鞣N應(yīng)激因素都有可能是誘發(fā)本病的原因［10］。

副豬嗜血桿菌只感染豬，具有很強(qiáng)的宿主特異性，未經(jīng)免疫的或是4周齡～8周齡的保育豬都容易感染。曾經(jīng)有人認(rèn)為本病是仔豬的散發(fā)性、應(yīng)激性疾病，然而無特定病原體種群的建立，增加了本病在全世界范圍內(nèi)的流行［11］。本病的發(fā)生主要與各種應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致豬的抵抗力下降有關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，健康豬也攜帶Hps，即使是無HPS暴發(fā)的豬場。如果豬群存在其他的傳染病，導(dǎo)致抵抗力下降時，使豬群更加易感Hps，致使病情更加復(fù)雜化，而且由于HPS復(fù)雜的流行病學(xué)，不同豬場間帶菌豬分布的多變性，給臨床診斷和治療都帶來了很大的困難。

3 臨床癥狀

根據(jù)臨床癥狀和病程，感染Hps的臨床癥狀可以是急性的，也可以是慢性的，這主要取決于炎性損傷的部位和種群整體的免疫狀態(tài)，一般高度健康的豬群，發(fā)病很急，接觸病原后幾天內(nèi)就會發(fā)病，隨后可能出現(xiàn)死亡［12］。

3.1 急性型

一般膘情良好的豬會突然發(fā)病，體溫升高至40.5℃～42℃，精神沉郁，食欲下降，咳嗽，呼吸困難并表現(xiàn)為腹式呼吸。體表皮膚發(fā)紅，耳稍發(fā)紫，指壓不褪色。有時腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)會發(fā)生炎癥，驅(qū)趕時病豬發(fā)生尖叫，共濟(jì)失調(diào)［13］。臨死前常常側(cè)臥或四肢呈劃水樣，一般無明顯癥狀而突然死亡，有時發(fā)病1d～5d死亡。

3.2 慢性型

多發(fā)生于保育階段的豬，常由急性型轉(zhuǎn)化而來，一般呈慢性經(jīng)過，病豬多見關(guān)節(jié)和后腿明顯腫脹，生長不良，衰弱，被毛粗亂，出現(xiàn)間歇熱，結(jié)膜發(fā)紺，隨后全身發(fā)紫，站立不穩(wěn)，有時頭頂墻角而不能收回，進(jìn)行性消瘦，有時甚至是因衰竭而死亡，同時也易受沙門菌、多殺性巴氏桿菌等其他病原微生物的侵害而發(fā)生繼發(fā)或并發(fā)癥［14］。

4 病理變化

4.1 病理剖檢變化

病豬皮膚發(fā)紺，耳背面尤為明顯。主要特征為多纖維性漿膜炎和多關(guān)節(jié)炎，全身淋巴結(jié)腫大、出血，切面多汁外翻。胸腔積液呈淡紅色并伴有大量纖維素滲出及凝血塊。肺臟呈纖維素性胸膜肺炎，膨脹呈暗紫紅色，充血、出血，有時表面還覆有纖維素性滲出物，常常與胸壁粘連。在病程較長的病例中，常常因?yàn)檠仔詽B出物，使心外膜和心臟粘連在一起，形成明顯的“絨毛心”，成為本病最具特征的病理變化［15］。病死豬脾臟腫大，體積為正常的2倍～3倍，周邊出現(xiàn)壞死灶，切開腫大的關(guān)節(jié)，有大量纖維素性滲出物。此外，有時腎臟和腸道也有明顯的病理變化。

4.2 病理組織學(xué)變化

4.2.1 心臟 表面有大量的纖維素滲出，其中含有大量的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。表層心肌纖維腫脹，排列紊亂，斷裂，細(xì)胞腫脹及壞死。間質(zhì)毛細(xì)血管充血，有炎性細(xì)胞浸潤。

4.2.2 肺臟 呈纖維素性胸膜肺炎，有漿液滲出，支氣管、肺泡內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤，其中以中性粒細(xì)胞為主。原有的肺臟被膜消失。肺小葉嚴(yán)重充血、出血，有大量紅細(xì)胞滲出，并伴有炎性細(xì)胞浸潤［16］。

4.2.3 脾臟 脾炎，表面有網(wǎng)狀纖維素滲出，其間有大量的炎性細(xì)胞和少量紅細(xì)胞。結(jié)締組織增生、水腫，血管擴(kuò)張充血，平滑肌纖維腫脹、崩解，脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)白髓體積縮小，邊緣區(qū)和紅髓出血。有時脾小體的生發(fā)中心也變小甚至觀察不到生發(fā)中心［17］。

4.2.4 肝臟 表面有纖維素滲出，其間有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞，常常由于中性粒細(xì)胞的崩解而形成膿腫。肝細(xì)胞腫大、壞死，形成壞死灶，中央靜脈擴(kuò)張充血，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞脫落，肝小葉間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，局部小葉間質(zhì)增生［18］。

此外，有時也伴隨有腦膜炎，腸道炎癥的發(fā)生，而且有中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤。

5 診斷

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，確診還需要做進(jìn)一步的細(xì)菌分離鑒定。通常實(shí)驗(yàn)室可以無菌采集病死豬心臟、脾臟、肺和淋巴結(jié)等處病料，無菌接種于巧克力瓊脂板上，然后垂直于劃線接種金黃色葡萄球菌，在溫度為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48h，可見明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，有助于對本病的診斷。另外，還可以對原代培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行PCR鑒定，也可以通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)等血清學(xué)方法做進(jìn)一步確診［19］。

Turni C等［6］通過用編碼2個轉(zhuǎn)錄抑制因子（IF2-IF2α）和（IF2β）的InfB基因?yàn)榘谢?，利用?shí)時PCR對Hps野外株的診斷獲得了較理想的效果。與存在特異性問題的常規(guī)PCR相比，實(shí)時PCR對于HPS的診斷結(jié)果非常可靠，因此實(shí)時PCR的高特異性和敏感性成為診斷HPS非常有效的方法，這一方法的應(yīng)用也將提升實(shí)驗(yàn)室診斷HPS的能力，特別是不具備Hps培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室。

Olvera A等［2］通過試驗(yàn)證實(shí)Hps中含有一個與毒力相關(guān)的自身運(yùn)載體（vtaA）基因，而且通過分析它們的轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域，可以將這一基因分成三部分，基因組雜交比較結(jié)果顯示vtaA-3具有高度的保守性，因此以vtaA基因?yàn)榘谢颍枚嘀豍CR可以有效的診斷出Hps的感染以及區(qū)分出分離株中非致病性菌株的存在。也有人以16SRNA基因?yàn)榘谢騺碓\斷Hps的感染，但是結(jié)果較其他方法存在一定的差異［17］。最后要做出正確的診斷，還需要臨床工作者豐富的診斷經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合臨床癥狀和病理變化做出科學(xué)的診斷結(jié)果。

6 防控

6.1 預(yù)防

目前對本病的預(yù)防還存在一定的局限性，只能從日常的飼養(yǎng)管理和疫苗免疫等方面著手，到現(xiàn)在為止，還沒有一種特效的多價疫苗能夠有效地預(yù)防本病的發(fā)生，而且由于致病菌的多變異性，疫苗的交叉保護(hù)也很差。

先天免疫反應(yīng)是脊椎動物防御病原微生物入侵的第一道防線，這期間起主要作用的是中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞做為先天免疫的主要成分，對宿主防御病原微生物的感染起著至關(guān)重要的作用，通過釋放細(xì)胞因子和趨化因子，維持宿主的免疫反應(yīng)［12］。因此，可以從以下幾點(diǎn)保護(hù)宿主的先天免疫，預(yù)防本病的發(fā)生。

6.1.1 嚴(yán)格執(zhí)行日常的飼養(yǎng)管理制度 保持圈舍內(nèi)外良好的衛(wèi)生環(huán)境，溫度、濕度適宜，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)密度適中，不同日齡的豬不混養(yǎng)。還要對外來車輛和人員進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，以免帶入外源性致病菌株。另外還要堅(jiān)持“全進(jìn)全出”，發(fā)現(xiàn)疑似病例要馬上隔離或捕殺淘汰，并進(jìn)行環(huán)境消毒和疫苗免疫，以防病原菌的傳播擴(kuò)散。

6.1.2 藥物預(yù)防和免疫接種 定期在飼料和飲水中加入一定量的慶大霉素、氟苯尼考、阿莫西林等抗生素可以有效的預(yù)防該病的發(fā)生，疫苗的使用也是有效控制此病發(fā)生的方法之一，但是由于該病的病原菌血清型較多，致病菌株多樣性的存在，不同血清型之間疫苗的交叉保護(hù)較差等原因，最好使用副豬嗜血桿菌多價滅活苗，有條件的豬場可以采集本場的病料制做自家苗，以更好的預(yù)防本病的發(fā)生。

OMPA是革蘭陰性菌的主要外膜蛋白，具有高度保守性，它的主要功能是參與細(xì)胞膜的形成、噬菌體結(jié)合、細(xì)胞生長和侵害哺乳動物細(xì)胞等，Hps也含有這種蛋白。有研究表明，免疫接種血清中抗體能定向?qū)筄MPs，而且OMPs的免疫原性較Hps的其他成分都高，所以O(shè)MPA有可能成為治療HPS亞單位疫苗的候選者［20］。

6.2 治療

近些年來，由于斷奶的提前和三點(diǎn)生產(chǎn)方式的使用等生產(chǎn)方式的改變，使Hps感染成為引起高死亡率、給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因，特別是對無特定病原菌的豬群［21］。當(dāng)豬群中出現(xiàn)臨床癥狀或嚴(yán)重的病理變化時，許多抗生素的治療效果都不是很理想，僅能控制癥狀的進(jìn)一步惡化。而且不同血清型之間對同一種抗生素的敏感性也存在很大的區(qū)別，在用藥治療前最好先對分離菌株做藥敏試驗(yàn)，以選擇最好的藥物進(jìn)行治療。

Guo L L等［11］在研究氟喹諾酮抵制Hps的分子特征試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)深入理解氟喹諾酮抵制Hps的機(jī)制可以有效的控制和治療Hps感染。然而由于血清型的多樣性和一部分非致病性菌株的存在，沒有可以提供有效交叉保護(hù)免疫的疫苗，因此抗菌藥物的應(yīng)用成為日趨重要的有效抵制此病原體的方法。不幸的是，氟喹諾酮的廣泛使用許使多國家的Hps產(chǎn)生了耐藥性。到目前為止，尚未闡明氟喹諾酮抵制Hps的機(jī)制，但相信可以為以后的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

Tian H B等［3］在應(yīng)用ELISA方法探討MAb1D8與Hps血清型反應(yīng)敏感性的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)中和性MAb1D8能夠與所有的15種和野外分離株HLJ-018反應(yīng)。相比之下被動免疫結(jié)果也表明用1D8腹腔內(nèi)接種小鼠，能夠有效地抵制Hps在血液、肺、脾、肝等處的寄居，而且還能夠延長生存時間。此外，被動轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)表明，MAb1D8能夠使小鼠免受同源或異源性Hps的攻擊。對于內(nèi)源性致病菌的攻擊，疫苗是一條有效地控制方式，但是在交叉保護(hù)試驗(yàn)中也出現(xiàn)了變異，因此必須尋求新的治療方法。

7 結(jié)語

迄今為止，研究人員已對HPS進(jìn)行了一系列的研究探索，也取得了許多顯著的成就，但是仍有許多問題尚未解決，比如許多分離株的血清型還不能分類定型，Hps感染的分子基礎(chǔ)也不十分清楚，在實(shí)踐中PCR方法和Southern blot方法的應(yīng)用也存在困難［19］。這些難題都需要科學(xué)工作者進(jìn)一步的研究探討，以更加深入的了解HPS和尋找到一種更好的診斷治療方法。

以前認(rèn)為本病只會在應(yīng)激條件下的豬只中發(fā)生，但是現(xiàn)在也有無應(yīng)激豬只發(fā)病的報(bào)道，這可能是因?yàn)橐环N非致病性血清型的流行影響了其他致病菌株的檢測，因而健康豬只不適宜用于所有血清型的檢測，另外，樣本量的大小對于一個農(nóng)場中所有血清型的檢測也是非常重要的。

近些年來以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗備受關(guān)注，通過免疫保護(hù)分析，鑒定出許多具有免疫原性的OMPs，這對于單價和多價亞單位疫苗的生產(chǎn)是至關(guān)重要的，但是有報(bào)道稱Hps OMPA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是有限的，還有待于進(jìn)一步證實(shí)。另外，通過觀察基因圖譜可以篩選出潛在的宿主代理，可以減少Hps的流行和進(jìn)一步理解Hps的致病機(jī)制。

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