胰島分離純化方法概述

高 茜，任曙光，吳建華，巨英超，王 原＊

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實驗動物中心，河北石家莊 050011）

胰島是胰腺的內(nèi)分泌部分，是在胰臟腺泡之間散在的細(xì)胞團。胰島細(xì)胞按其染色和形態(tài)學(xué)特點，主要分為A細(xì)胞、B細(xì)胞、D細(xì)胞及PP細(xì)胞。B細(xì)胞占胰島細(xì)胞的60%～70%，分泌胰島素（insulin）。胰島B細(xì)胞可根據(jù)血糖濃度調(diào)節(jié)胰島素釋放量，維持血糖濃度穩(wěn)定。1型糖尿病為胰島B細(xì)胞功能受損引起的胰島素分泌絕對或相對不足，需長期注射胰島素維持生命，胰島移植創(chuàng)傷小，并可消除常規(guī)治療產(chǎn)生的低血糖癥狀，是治療1型糖尿病最有前景的方案［1－2］。2型糖尿病的特點為胰島素抵抗或胰島素分泌不足。疾病早期為胰島素抵抗，胰島素代償性分泌增加以保持正常糖耐量，經(jīng)過漫長的病理過程，血中胰島素效力減弱、胰島素代償性分泌減少，經(jīng)過體內(nèi)反饋系統(tǒng)的啟動，首先累及胰島，使之長期超負(fù)荷工作失去代償能力。為此，針對胰島的研究顯得尤為重要，分離純化高純度、有活性、有功能的胰島不僅是體內(nèi)、外胰島移植的基礎(chǔ)，而且可以直接作為體外功能檢測的指標(biāo)。胰島的獲得需經(jīng)過胰腺消化、分離純化，然后進行產(chǎn)量和活性鑒定、體外功能檢測，本文對胰島分離純化過程的各種方法進行了綜述，探討如何提高分離純化后胰島的產(chǎn)量及質(zhì)量，可用于今后胰島的相關(guān)后續(xù)研究。

1 胰島的分離

胰島分離是采用特異的消化酶消化胰腺獲取胰島細(xì)胞的過程。膠原酶可以高效消化胰島周圍結(jié)締組織和其他胰腺組織，是胰島分離應(yīng)用最廣泛的試劑。膠原酶是一種從梭形桿菌中提煉出的蛋白酶，包括膠原酶、梭形菌酶、胰蛋白酶及分散酶，它通過分解原蛋白和其他蛋白，可以更好的分離胰島和其他組織［3］。

目前胰島的分離主要采用以下幾種方法。

1.1 切碎法

標(biāo)準(zhǔn)化組織切碎消化法（切碎法standard chopped tissue digestion process）是 Moskalevski S于1965年首創(chuàng)的，之后被Lacy P E和 Kostianovsky M改良［4］。首先體外分離胰腺組織，切成碎片，置于膠原酶液中37℃消化。此種方法雖然操作簡單，然而膠原酶溶液很難到達組織塊的內(nèi)部，會造成組織內(nèi)外消化速度不一致，導(dǎo)致胰島的活力較差，且極易損傷胰島［5］。

1.2 膽總管穿刺法

Gotoh M等［6］建立的膽總管內(nèi)膠原酶灌注技術(shù)無需切碎胰腺，直接穿刺膽管并置管，注入膠原酶液，使之膨脹，再鈍性分離，37℃水浴消化。此種方法能充分?jǐn)U張胰腺，消化間質(zhì)組織，提高了分離效果，所得產(chǎn)量明顯高于切碎法，并以靜態(tài)消化的形式減少了機械消化對胰島的損傷。目前，逆行胰管注射膠原酶的方法，已被廣泛應(yīng)用于胰島分離的研究，且被不斷更新改進［7］。由于小鼠的膽總管非常細(xì)小，應(yīng)用此方法分離小鼠胰島對置管技術(shù)要求較高，穿刺針需用超細(xì)的軟管，而且禁忌反復(fù)穿刺，Li D S等［8］提出于肝總管與膽囊管交叉處穿刺更加簡便易行。

1.3 膽囊穿刺灌注

近些年有學(xué)者［9－10］在膽總管穿刺術(shù)基礎(chǔ)上提出膽囊穿刺灌注的方法。于膽囊頂部穿刺，排出膽囊和膽總管內(nèi)膽汁，結(jié)扎膽囊中部及膽總管入十二指腸處，使消化液緩慢注入胰腺內(nèi)。祁小平等［9］在消化液和分離液中加入了大豆胰酶抑制劑和牛血清白蛋白組分V，使胰島產(chǎn)量、活性明顯提高。后有學(xué)者認(rèn)為小鼠膽道系統(tǒng)變異多，有時膽囊管開口較低，夾閉膽總管的同時可能夾閉膽囊管開口，導(dǎo)致膠原酶液無法逆行至胰腺，另外小鼠膽囊頸較為狹窄彎曲，灌注時無法達到有效的壓力，胰腺充盈并不理想［11］。

1.4 多點穿刺注射法

李明、蔡德鴻等人［5］同時摘取多只小鼠的胰腺，對胰頭、胰體、胰尾多部位反復(fù)注射膠原酶－P溶液，37℃水浴消化。此方法簡便、成功率高，避免了傳統(tǒng)切碎法消化不均勻，接近了膽總管內(nèi)灌注的效果，且?guī)字灰认偻瑫r消化，避免了單只消化移植供源不足的問題。

2 胰島的純化

胰腺組織經(jīng)水浴消化后，胰島與間質(zhì)組織混雜在一起，需將胰島與間質(zhì)組織分離，才能得到純化的胰島，用于研究和移植。主要的方法有以下幾種。

2.1 Ficoll密度梯度離心法

目前，設(shè)置密度梯度離心的方法被廣泛應(yīng)用于胰島的純化。Ficoll400是一種水溶性聚蔗糖，可形成等滲的密度梯度，將胰島組織與最高密度梯度液混勻，依次加入3種密度梯度遞減的溶液，離心后胰島大部分存在于第一、二層界面。此方法所得胰島產(chǎn)量及純度較高，已被廣泛應(yīng)用并不斷改進［12］。袁宇等［13］對Ficoll液的比重和加入順序做了調(diào)整，阻止體積較大的胰島繼續(xù)下沉，使胰島從外分泌腺組織中分離出來，改進后的方法提高了胰島的產(chǎn)量，增加了胰島的純度和成活率。各項研究均顯示間斷密度梯度離心的方法獲得胰島的純度較高，但梯度液配制過程繁瑣，反復(fù)吸管加樣有污染的可能。徐艷艷等［14］在研究大鼠胰島分離純化技術(shù)時比較了Ficoll400和Ficoll－PaquePLUS兩種離心液的純化效果，結(jié)果顯示Ficoll－PaquePLUS離心液純化的胰島純度更高，而且操作更加簡便。

2.2 Histopaque純化法

張梅等［15］將終止消化后的胰島重懸于5mL Histopaque溶液，再加入5mL Hanks液，離心后吸取兩層之間的胰島。此方法操作簡便，獲得的胰島純度較低，需通過顯微鏡下手檢，胰島純度才可達100%。

2.3 單一密度梯度離心法

近些年，李明等［5］應(yīng)用自制的推進式離心管結(jié)合單密度梯度法快速純化胰島獲得了一定的認(rèn)可。該法使用自制的20mL推進式離心管抽取密度梯度液10mL（25%Ficoll－400 1.088g／mL），將5mL細(xì)胞懸液泵入到梯度液之上，離心后保留第一層下1／3及第二層的上1／3段，使用RMPI－1640液離心洗滌2次，混于Hanks液。此方法通過離心管內(nèi)的活塞裝置進行加樣和出樣，將消化物加載于連續(xù)密度梯度液之上，離心后胰島大部分在分界面上下連續(xù)分布，減少了反復(fù)吸管加樣帶來的污染。

2.4 過濾法

Kopska T等［16］利用胰島細(xì)胞可以懸浮于培養(yǎng)液表面的特性，反復(fù)過濾、培養(yǎng)，使胰島細(xì)胞團和胰腺外分泌組織分開，形成單層培養(yǎng)。此種方法簡便易行、節(jié)省時間、價格便宜，不僅可以獲得高產(chǎn)量、有功能的胰島，而且避免了使用梯度液過程中污染的可能。

2.5 碘克沙醇純化法

碘克沙醇分離液是一種新型無內(nèi)毒素的等滲密度梯度液，可提高胰島恢復(fù)率、減少純化過程對胰島的損傷，Noguchi H 等［17］采用1.085、1.090、1.095、1.100、1.105g／mL的碘克沙醇密度梯度純化人胰島，胰島產(chǎn)率和復(fù)蘇率都顯著提高。于湄等［18］比較了Ficoll、淋巴細(xì)胞分離液、及碘克沙醇對大鼠胰島純化后的產(chǎn)量、純度、活性、形態(tài)以及體外功能進行評估，發(fā)現(xiàn)經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液及碘克沙醇純化的胰島純度和存活率均顯著增加，淋巴細(xì)胞分離液與碘克沙醇對胰島純度和存活率無明顯差異。

3 胰島的產(chǎn)量及活性鑒定

胰島的產(chǎn)量及活性是鑒定胰島分離純化效果的重要指標(biāo)。

3.1 特異性染色

胰島β細(xì)胞含鋅，雙硫腙（DTZ）可與鋅螯合而將胰島特異性染成猩紅色，非胰島β細(xì)胞不著色［19］。

3.2 胰島計數(shù)

用移液器在胰島懸液中取樣50μL，重復(fù)取樣3次，分別鏡檢計數(shù)DTZ陽性細(xì)胞團數(shù)，按以下公式計數(shù)胰島：胰島數(shù)＝（3次陽性總數(shù)／3）×20×樣本量（mL），將1個直徑為150μm的胰島團塊稱為1個胰島當(dāng)量（IEQ）［1，20］。

3.3 胰島活性鑒定

細(xì)胞排除法或DNA結(jié)合染色被用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，二乙酸熒光素（FDA）可以進入正常細(xì)胞將其染成藍(lán)色，而碘化丙啶（PI）可穿過凋亡或即將死亡細(xì)胞的膜染成紅色，F(xiàn)DA／PI表示胰島生存能力［21］。吖啶橙熒光素（AO）／碘丙啶（PI）熒光染色時，AO可透過正常細(xì)胞膜顯示綠色，死細(xì)胞染成紅色，胰島細(xì)胞成活率用胰島活細(xì)胞占所有胰島活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)百分比表示［22］。

4 胰島素體外釋放試驗

胰島通過分泌胰島素調(diào)節(jié)血糖水平，胰島素釋放試驗可用來鑒定胰島的功能［23］。過夜培養(yǎng)有利于胰島從損傷中修復(fù)。胰島在葡萄糖刺激下可釋放胰島素，手工挑選胰島，置于高濃度、低濃度葡萄糖中培養(yǎng)，測定胰島素濃度，葡萄糖刺激指數(shù)（stimulation index，SI）＝高糖時胰島素濃度／低糖時胰島素濃度，用來反映胰島功能。健康胰島SI為2～20［7］。合適的培養(yǎng)條件對胰島功能發(fā)揮至關(guān)重要，經(jīng)11 mmol／L葡萄糖培養(yǎng)胰島細(xì)胞凋亡率最低，低于此濃度的葡萄糖會減少胰島素分泌，而濃度過高則會帶來顯著毒性反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，有研究顯示此種毒害性具有Ca2＋依賴性，而三羧酸可以抑制此種毒害作用［24－25］。Groot M 等［26］研 究 大 鼠 胰 島 產(chǎn) 量 和功能具有供體依賴性時發(fā)現(xiàn)加入了3－異丁基－1－甲基黃嘌呤（IBMX）的培養(yǎng)基較單純葡萄糖刺激產(chǎn)生的胰島素水平高出1／5，該試驗證明IBMX可引起高效胰島素分泌反應(yīng)，且與供體依賴性無關(guān)。

5 影響因素

胰島分離純化是個極其復(fù)雜的過程，微小的環(huán)節(jié)也會影響試驗結(jié)果，其中以胰腺消化最為重要。若消化時間過短則消化不足，胰島與外分泌腺泡脫離不徹底，在純化過程中會因胰島密度改變而導(dǎo)致獲得率下降；若消化時間過長則消化過度，膠原酶對胰島結(jié)構(gòu)功能會造成損傷。在溫度37℃、膠原酶溶液pH 7.8、［Ca2＋］7.5mmol／L，加入10mmol／L羥乙基 哌 嗪 乙 硫 磺 酸 （4－（2－h(huán)ydroxyethyl）－1－piperazineethanesulfonic acid，HEPES）保持pH 相對穩(wěn)定，膠原酶－P濃度為1.0mg／mL的條件下，消化25 min能獲得最高的胰島產(chǎn)量［22］。有研究比較了幾種不同濃度的膠原酶V對大鼠胰島分離純化產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示膠原酶濃度在1.0mg／mL～1.2 mg／mL的情況下，胰腺消化時間一般在15min左右，另外，膠原酶的其他參數(shù)對胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量也會產(chǎn)生不同的影響，包括生產(chǎn)公司、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)工藝等，而且同一廠家不同批次的膠原酶也會對結(jié)果產(chǎn)生一定的影響［27］。另有研究顯示［28］，胰島在整個分離和培養(yǎng)過程中都無有效的氧供，由此可引起細(xì)胞的死亡或凋亡，在整個分離純化過程中加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）可以抑制胰島細(xì)胞凋亡，對胰島功能的損害起到了抑制效果，從而對胰島的活力具有保護作用。

6 小結(jié)

胰島的分離純化是胰島移植的基礎(chǔ)，也是胰島體外功能檢測的前提。關(guān)于各種藥物對糖尿病治療效果的研究越來越多，而評價藥物治療效果的一項重要因素就是對于胰島功能的檢測，因此獲得高質(zhì)量高產(chǎn)量的胰島極其重要。雖然關(guān)于胰島的分離純化的研究已經(jīng)日漸深入，研究技術(shù)得到不斷改進，分離純化方法已趨向完善，然而胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量仍不十分令人滿意，很多試驗中的細(xì)節(jié)需要被重視起來。雖然目前的試驗研究仍未解決分離純化過程的所有問題，但胰島制備的前景仍是相當(dāng)可觀，例如，非膠原酶試劑的探究，分離后周圍環(huán)境對胰島細(xì)胞的生存及功能修復(fù)作用及低成本分離液的出現(xiàn)等。相信隨著科研技術(shù)的飛速發(fā)展，胰島分離純化過程的高效性、一致性會進一步提高。

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