豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫抑制研究進(jìn)展

敬曉棋，孟建斌，高曉陽(yáng)，馮 平，閆海龍，劉生耀，于鴻浩，胡軍和，屈 雷＊

（1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)研究中心，陜西榆林 719000；2.神木縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，陜西神木 739100）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染?。?］。20世紀(jì)80年代，PRRS在北美洲和歐洲先后出現(xiàn)，目前已在全世界范圍內(nèi)流行。PRRS在世界范圍內(nèi)的頻繁爆發(fā)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如PRRSV突變株在中國(guó)和越南引起的“豬無(wú)名高熱病”導(dǎo)致兩國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成重創(chuàng)［2］。初次發(fā)病的豬一般表現(xiàn)急性疾病癥狀，如精神沉郁、食欲不振、有時(shí)伴有發(fā)熱、呼吸困難、四肢末端發(fā)紺等，急性發(fā)病期時(shí)或隨后即表現(xiàn)出嚴(yán)重的母豬繁殖障礙癥狀，如弱胎、死胎、木乃伊胎及斷奶前仔豬高死亡率等［3］。

PRRSV株間的遺傳、抗原性及致病性等在疾病的診斷、控制和預(yù)防中具有重要作用，然而由于PRRSV毒株間抗原性的差異及其引起機(jī)體的免疫抑制，不僅影響該病的控制和疫苗的研發(fā)，而且影響豬瘟等其他的傳染病免疫防御。本文在PRRSV病毒生物學(xué)的基礎(chǔ)上，對(duì)PRRSV抗原逃避、中和抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞免疫的延遲、抗體依賴(lài)性增強(qiáng)、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞功能、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化等抑制機(jī)體天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的途徑予以論述，以期對(duì)PRRSV防控及疫苗開(kāi)發(fā)提供有益的參考。

1 PRRSV的生物學(xué)特性

PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的單鏈、正鏈RNA囊膜病毒［4］。PRRSV分為歐洲株和北美株2個(gè)類(lèi)型，二者在抗原性和遺傳性等方面都存在較大差異，但能引起同樣的疾病癥狀。PRRSV基因組約15kb，包含5′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3至ORF7等9各開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），3′非翻譯區(qū) UTR 及1個(gè)poly（A）尾［5］。PRRSV基因組5′端的 ORF1a和ORF1b約占整個(gè)基因組的75%，編碼nsp1α，nsp1β，nsp2至nsp12共13非結(jié)構(gòu)蛋白（non－structural proteins，nsp）。近來(lái)研究表明nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4和nsp11能以不同的強(qiáng)度抑制干擾素（interferon，IFN）－β啟動(dòng)子，說(shuō)明PRRSV nsps能夠通過(guò)削弱破壞I型IFN反應(yīng)破壞機(jī)體的天然免疫反應(yīng)［6］。

PRRSV基因組3′端編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)性蛋白，ORF2a和 ORF3、4、5編碼 GP2a、GP3、GP4和 GP5等4個(gè)N端糖基化的囊膜相關(guān)蛋白，ORF2b和ORF6編碼2個(gè)非糖基化囊膜蛋白E和M［7］，ORF7編碼基因組外的核衣殼蛋白N［8］。GP5蛋白是包含主要中和表位的糖蛋白，GP5和M蛋白通過(guò)二硫鍵形成的異源二聚體，能夠與肺泡巨噬細(xì)胞表面PRRSV受體pCD 1 6 9結(jié)合［9］。GP 2a和GP 4與肺泡巨噬細(xì)胞膜上的PRRSV受體pCD163能夠相互作用［10］。

2 PRRSV的免疫抑制作用

初次感染PRRSV的豬一般表現(xiàn)為急性癥狀，如果能夠耐過(guò)1個(gè)月左右急性感染期PRRSV的豬通常轉(zhuǎn)化為慢性的持續(xù)感染，此時(shí)病毒滴度維持在較低的水平，然而體內(nèi)病毒的完全清除至少需要150d，大大超出了商品豬上市的生長(zhǎng)周期。盡管對(duì)于機(jī)體不能快速清除體內(nèi)PRRSV的機(jī)制還不清楚，但主要的原因可能包括PRRSV的免疫逃避和豬自身沒(méi)有產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。

2.1 豬肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)PRRSV的傳播

豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophage，PAM）是PRRSV感染和傳播的主要細(xì)胞類(lèi)型，研究表明PAM膜表面存在pCD169和pCD163受體分別與PRRSV的穿入和脫殼有關(guān)［11］。此外，PAM細(xì)胞隱藏了感染的PRRSV，使病毒蛋白不能表達(dá)于漿細(xì)胞表面，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)無(wú)法獲得病毒信息，使抗體依賴(lài)性或補(bǔ)體介導(dǎo)的裂細(xì)胞作用不能裂解被感染細(xì)胞［12］。

2.2 PRRSV對(duì)天然免疫的抑制

機(jī)體抗PRRSV的天然免疫是非常弱的，導(dǎo)致其后的體液免疫和細(xì)胞免疫延遲及病毒的持續(xù)感染。IFN－α是機(jī)體抗病毒應(yīng)答的重要組成部分，然而 PRRSV 不 能誘導(dǎo)IFN－α 分泌［13－14］，因此僅 能 誘導(dǎo)機(jī)體分泌少量的炎性因子，也不能有效活化和動(dòng)員自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）［15］。PRRSV介導(dǎo)的I型IFN分泌抑制，是由于位于感受分子RNA螺旋酶RIG－I下游的IFN－β啟動(dòng)子刺激分子1（IFN－βpromoter stimulator 1，IPS－1）的活化受到了干擾。IPS－1失活使了IFN調(diào)控因子（IFN regulatory factor，IRF）3不能活化，從而使I型IFN分泌抑制［13］。

2.3 中和抗體產(chǎn)生的延遲

PRRSV中和抗體是病毒清除中的關(guān)鍵，并能夠有效防止豬再次感染PRRSV，然而PRRSV感染后，針對(duì)主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5的中和抗體似乎比針對(duì)其他結(jié)構(gòu)蛋白和nsp2的中和抗體出現(xiàn)的晚，導(dǎo)致豬在感染早期不能有效的清除病毒［16］。中和抗體延遲產(chǎn)生的可能原因有以下3點(diǎn)：①GP5的胞外結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)免疫顯性表位（表位A或"引誘"表位），能夠在感染早期誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)大的非中和抗體免疫反應(yīng)，導(dǎo)致位于其下游的中和表位（表位B）減弱或被屏蔽而不能產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答［17］；②在GP5表位B側(cè)翼的N連接糖基化位點(diǎn)存在的大量甘露糖減弱了PRRSV對(duì)中和抗體的敏感性，從而削弱了表位B的免疫原性［18］；③PRRSV具有多種抑制機(jī)體天然免疫反應(yīng)的機(jī)制，特別是對(duì)I型IFN的分泌抑制，使包括體液免疫在內(nèi)的機(jī)體天然免疫反應(yīng)受到抑制［19］。因此，理想的PRRSV疫苗應(yīng)該能夠快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的中和抗體且不能抑制機(jī)體的抗PRRSV天然免疫反應(yīng)。

2.4 PRRSV抗體依賴(lài)性增強(qiáng)

PRRSV所誘導(dǎo)免疫的特征之一是PRRSV特異性母源抗體或疫苗抗體能使病毒更易于侵入靶細(xì)胞，從而導(dǎo)致感染增強(qiáng)［20］，這種現(xiàn)象也稱(chēng)作病毒感染的抗體依賴(lài)性增強(qiáng)（antibody－dependent enhancement，ADE）。盡管其機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明，但ADE被認(rèn)為是PRRSV疫苗研發(fā)的障礙之一。其他RNA病毒ADE機(jī)制的研究表明除了增強(qiáng)病毒侵入外，ADE也能抑制機(jī)體的天然抗病毒應(yīng)答，特別是宿主的I型IFN系統(tǒng)［21］。此外，由于ADE時(shí)通過(guò)自分泌和旁分泌產(chǎn)生的大量IL－10所造成的抗炎和免疫抑制環(huán)境有助于病毒的傳播［22］。PRRSV感染豬的支氣管肺泡灌洗液中IL－10顯著升高，可能是上調(diào)了PAM 的IL－10表達(dá)［23］，從而導(dǎo)致IFN－α／β及其他炎性因子分泌的降低。因此，削弱或消除疫苗免疫誘導(dǎo)的ADE負(fù)面影響也應(yīng)該被看作PRRSV發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。

2.5 PRRSV對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞功能的抑制

樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）是外周免疫系統(tǒng)專(zhuān)業(yè)抗原遞呈細(xì)胞（antigen－presenting cells，APC），能夠感知和捕獲病毒從而誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［24］。血液中未成熟DCs被侵入的外源抗原誘導(dǎo)遷移至受感染組織并獲取抗原信息，將吞噬的抗原通過(guò)MHC分子加工成具有免疫原性的多肽并遞呈給T細(xì)胞［24］。PRRSV的免疫逃避機(jī)制是否是通過(guò)DCs還有待進(jìn)一步研究，但PRRSV和機(jī)體的DCs間存在相互作用。DCs能夠分泌干擾素、活化特定的炎性細(xì)胞因子和啟動(dòng)特定的T細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)了機(jī)體對(duì)PRRSV反應(yīng)。漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（Plasmacytoid DCs，pDCs）是一類(lèi)關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，能夠在早期天然免疫階段表達(dá)高水平抗病毒的I型IFN［25］。有研究表明用PRRSV刺激體外培養(yǎng)的豬pDCs時(shí)，pDCs不能分泌IFN－α、IL－6、IL－8、IL－12、IFN－γ 或 TNF－α［14，26－27］，而 且 PRRSV 感 染 髓 源DCs（bone marrow－derived DCs，BMDCs）和單核細(xì)胞源DCs（monocyte－derived DCs，MDDCs）時(shí)，能夠?qū)е屡c抗PRRSV免疫抑制有關(guān)的多種細(xì)胞因子和CD分子表達(dá)水平改變［28］。此外，體外克隆的豬DC－SIGN （pDC－SIGN）基因能夠增強(qiáng) PRRSV 在靶細(xì)胞間的傳播［29］，表明pDC－SIGN的功能可能是作為豬DCs上的附加受體使PRRSV在細(xì)胞傳播。因此，研究PRRSV與DCs相互作用過(guò)程中的信號(hào)途徑和分子、DCs傳播PRRSV的機(jī)制等，對(duì)PRRSV疫苗設(shè)計(jì)也具有重大意義。

2.6 PRRSV對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是一類(lèi)CD4＋、CD25＋、Foxp3＋T細(xì)胞亞群，是維持機(jī)體天然免疫、適應(yīng)性免疫平衡的關(guān)鍵細(xì)胞類(lèi)型。適應(yīng)性（或誘導(dǎo)性）Tregs被DCs誘導(dǎo)活化后能夠分泌高水平的IL－10或TGF－β，從而抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)并減弱宿主組織的損傷［30］。在體外用美洲型PRRSV刺激 MDDCs時(shí)CD4＋、CD25＋、Foxp3＋T細(xì)胞數(shù)量和Foxp3＋mRNA表達(dá)水平均升高，說(shuō)明PRRSV也能夠誘導(dǎo)Tregs的產(chǎn)生，而且這些Tregs能夠抑制PHA刺激的PBMC活性，然而該條件下PRRSV僅誘導(dǎo)TGF－βmRNA和蛋白水平升高，而對(duì)IL－10水平無(wú)明顯影響［31－32］。有意思的是在同樣的試驗(yàn)方案中，歐洲型PRRSV與MDDCs共培養(yǎng)卻不能誘導(dǎo)CD25＋、Foxp3＋、Tregs和 TGF－β，表明PRRSV誘導(dǎo)的免疫抑制可能是型或株依賴(lài)性的［31］。因此，體內(nèi)PRRSV感染是否啟動(dòng)了Tregs活化并導(dǎo)致豬的免疫抑制還有待進(jìn)一步的研究。

3 小結(jié)與展望

PRRSV不僅對(duì)豬造成嚴(yán)重的危害，而且可通過(guò)抗原逃避、延遲中和抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞免疫、抗體依賴(lài)性增強(qiáng)、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞功能、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化等多種方式抑制機(jī)體天然和實(shí)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。PRRSV對(duì)豬免疫應(yīng)答的調(diào)控，不僅使PRRSV在機(jī)體的持續(xù)感染，而且由于機(jī)體免疫水平的降低使豬瘟、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型等免疫失敗或者繼發(fā)和混合感染，對(duì)豬病的預(yù)防、診斷和控制造成更大的困難。目前，PRRSV疫苗免疫效果的不確定性也在于機(jī)體免疫的抑制，因此，將來(lái)在PRRSV疫苗研發(fā)當(dāng)中應(yīng)充分考慮到這些可能造成機(jī)體免疫抑制和病毒持續(xù)感染和增殖的因素。

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