RNA干擾的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景

陳貴元，譚德勇

（1.云南大學(xué)生命科學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南大理 671000）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物進(jìn)化過程中遺留下來的一種在轉(zhuǎn)錄后通過小RNA分子調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象〔1〕。它由雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）啟動(dòng)，在Dicer酶的參與下，把RNA分子切割為小分子干擾RNA（small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA），并特異性地與mRNA的同源序列結(jié)合，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。根據(jù)dsRNA作用效果分為3種類型：阻抑作用、部分降解和完全降解，其共同特點(diǎn)都表現(xiàn)為抑制作用，以達(dá)到降解或者關(guān)閉特定基因表達(dá)的目的。RNA干擾廣泛存在于生物界，在不同物種中RNA干擾被賦予不同的名稱，在植物體中被稱為基因共抑制（co-suppression），在真菌中被稱為基因阻抑（qulling），而在動(dòng)物體內(nèi)被稱為RNA干擾〔2-3〕。RNA干擾現(xiàn)象是Fire和Montgomerym〔1〕在1998年2月發(fā)現(xiàn)的，他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的純化后的單鏈RNA和經(jīng)純化的雙鏈RNA分別注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，單鏈RNA對基因抑制效應(yīng)十分微弱。相反，雙鏈RNA則能高效特異性地抑制相應(yīng)基因的表達(dá)。真菌、植物、水螅、渦蟲、錐蟲（Trypanosoma brucei）和小鼠等大多數(shù)生物中均存在RNA干擾現(xiàn)象〔4-6〕。2001年，Elbashir等〔7〕首次用長度約為19～23個(gè)堿基對的雙鏈siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘發(fā)基因沉默現(xiàn)象，證實(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也普遍存在RNA干擾機(jī)制，從而引起RNA干擾的研究熱潮。由于幾乎所有的物種都保留著RNA干擾的機(jī)制，這揭示了RNA干擾很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段，而且起著重要的作用，RNA干擾也越來越為人們所重視。本文對當(dāng)前RNA干擾的研究進(jìn)行了總結(jié)并對其應(yīng)用前景作了簡要介紹。

1 RNA干擾的作用機(jī)制

雖然科學(xué)家們運(yùn)用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的方法來探索RNAi的機(jī)制，但RNAi是由dsRNA誘導(dǎo)的多步驟、多因素參與的過程，其真正的機(jī)理尚未明了。目前認(rèn)為其可能分為以下幾個(gè)階段進(jìn)行〔1，8〕。

起始階段。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞，被Dicer核酸酶特異識(shí)別，以一種依賴ATP的形式將dsRNA切割成長約21～23 nt（或bp）的小片段siRNA，siRNA又被稱為引導(dǎo)RNA （guide RNA），是識(shí)別靶RNA（target mRNA）的標(biāo)志，siRNA的生成啟動(dòng)了RNA干擾反應(yīng)。

效應(yīng)階段。siRNA通過與核酸酶等蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），并依靠ATP提供能量解開siRNA雙鏈，激活RISC。活化后的RISC定位到與siRNA中的反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3′端12個(gè)堿基的位置切割mRNA，使靶mRNA降解。在RNA干擾的效應(yīng)階段，RISC復(fù)合物起了相當(dāng)重要的作用。siRNA與RISC復(fù)合物形成一種小干擾核糖蛋白粒子（small interfering ribonucleo protein particles，siRPP）。RISC與Dicer都具有RNA酶的活性，但是它們的底物卻不同，RISC常常針對單鏈RNA分子，而Dicer則針對雙鏈RNA分子。另一方面，它們酶切RNA分子的方式和酶切的產(chǎn)物也不同，Dicer屬于RNA內(nèi)切酶，而RISC則屬于RNA的外切酶。因此，它們是性質(zhì)和功能各異的兩種酶類復(fù)合物。

放大效應(yīng)。RNA干擾效應(yīng)階段的mRNA降解產(chǎn)物，反過來可以作為依賴RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP） 的RNA模板，合成雙鏈RNA分子，加入到RNA干擾的啟動(dòng)階段，從而放大RNA干擾的作用〔9〕。也就是說，在RNA干擾的啟動(dòng)和效應(yīng)階段，都存在著siRNA的擴(kuò)增和RNA干擾的放大效應(yīng)。另一方面也說明，RNA干擾的啟動(dòng)和效應(yīng)階段并不是兩個(gè)絕對獨(dú)立的過程，而是相互交錯(cuò)進(jìn)行的。

2 RNA干擾的作用特點(diǎn)

2.1普遍性RNA干擾的機(jī)制廣泛存在于不同物種的細(xì)胞內(nèi)，植物、微生物、動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)都保留了運(yùn)行RNA干擾的酶類〔10〕。把長的dsRNA或短的siRNA導(dǎo)入生物體細(xì)胞，都可激發(fā)RNA干擾、沉默基因表達(dá)。在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)，siRNA可在多種器官的細(xì)胞中，包括肝臟、脾臟、腎臟、血液系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、神經(jīng)系統(tǒng)、胚胎和造血干細(xì)胞等抑制特異基因的表達(dá)。此外，幾乎所有的基因都能通RNA干擾而被沉默〔4〕。

2.2 RNA干擾的高效性和濃度依賴性RNA干擾抑制目標(biāo)基因表達(dá)的效能非常高，無論是在體內(nèi)還是體外試驗(yàn)中，僅需少量的siRNA就能有效地抑制大量靶基因的降解。宋爾衛(wèi)等〔11〕對Fas抗原的siRNA治療小鼠暴發(fā)性肝炎模型實(shí)驗(yàn)中，siRNA的用量比過去文獻(xiàn)報(bào)道的反義寡核苷酸的用量少10倍以上，但是卻能達(dá)到同樣的抑制效果。這種高效強(qiáng)大的基因抑制功能主要是與RISC降解mRNA的效能強(qiáng)大。siRNA是否能夠比較容易接近mRNA靶目的片段與siRNA分子的穩(wěn)定有關(guān)。另外，RNA干擾效應(yīng)的強(qiáng)度隨著siRNA濃度的增高而增強(qiáng)〔12〕。

2.3高度特異性由dsRNA誘導(dǎo)的RNA干擾只引起與dsRNA同源的mRNA降解，對其它基因的表達(dá)不受影響，這是RNA干擾最顯著的特征〔13〕。因?yàn)閟iRNA對mRNA降解的選擇取決于siRNA的特異序列，所以siRNA是嚴(yán)格按照堿基配對的法則與靶mRNA結(jié)合。RNA干擾的特異性，不僅是siRNA應(yīng)用于基因研究時(shí)能準(zhǔn)確剖析具體基因功能的前提條件，也是它用于治療疾病時(shí)藥效強(qiáng)大、藥效專一、不良反應(yīng)小的基本保障。

2.4可遺傳性和時(shí)間效應(yīng)RNA干擾效應(yīng)可以穩(wěn)定地遺傳給子代，而且存在時(shí)間上的效應(yīng)。1998年Fire等〔1〕在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在線蟲中，通過注射的方式將siRNA注射到線蟲中能把RNA干擾的現(xiàn)象傳給第2代，但不能傳給第3代。而將dsRNA轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的細(xì)胞后，其功能缺失的表型可以持續(xù)9代。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的siRNA干擾具有時(shí)間效應(yīng)，注入dsRNA 2～3 d內(nèi)，RNA干擾顯著，接下來的1～2 d內(nèi)，靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到RNA干擾前的水平。RNA干擾作用的下降甚至消失，可能是由于siRNA活性下降，能被siRNA識(shí)別的序列發(fā)生點(diǎn)突變或者產(chǎn)生抗siRNA的抗體所至。

2.5可傳播性RNA干擾信號(hào)可以穿越細(xì)胞界限，向其它的組織細(xì)胞擴(kuò)散，引發(fā)系統(tǒng)性應(yīng)答。植物中RNA沉默的一個(gè)最顯著特征是通過植物大分子運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)擴(kuò)散。植物大分子運(yùn)輸系統(tǒng)有通過胞間連絲（plasmodesmata）進(jìn)行的細(xì)胞間運(yùn)輸和通過韌皮部（phloem）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行的長距離運(yùn)輸。在植物中，RNA干擾信號(hào)可以通過胞間連絲或脈管系統(tǒng)在細(xì)胞間傳遞。而在動(dòng)物中，RNA干擾信號(hào)的擴(kuò)散需要特殊蛋白參與，在膜上形成跨膜通道而傳播到整個(gè)機(jī)體。Feinberg和Hunter〔14〕通過對sid-1基因（系統(tǒng)性RNA干擾缺陷基因，可以編碼的蛋白質(zhì)含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域）的研究發(fā)現(xiàn)：線蟲細(xì)胞膜上的sid-1可以將雙鏈RNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，雙鏈RNA也可以從起始位置傳播到遠(yuǎn)的地方，甚至于全身。在人體和小鼠基因序列中也含有sid-1同源基因，這表明哺乳動(dòng)物體內(nèi)也存在全身性的RNA干擾的現(xiàn)象。

2.6 ATP依賴性有研究表明，去除ATP或者抑制ATP合成的復(fù)合體的樣品中，RNA干擾現(xiàn)象降低或消失，顯示RNA干擾是一個(gè)ATP依賴的過程〔15〕。因?yàn)锳TP能提供Dicer和RISC的酶切反應(yīng)所需的能量。研究還發(fā)現(xiàn)，人的Dicer酶優(yōu)先在dsRNA的終末端剪切dsRNA而不需要ATP的參與。這是否表明ATP只對RNA干擾中的某些階段起作用，還有待于更多的實(shí)驗(yàn)來證明。

3 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用前景

3.1基因功能研究上的應(yīng)用RNAi能夠在真核生物細(xì)胞中抑制特異性基因的表達(dá)，產(chǎn)生類似基因敲除的效果。隨著現(xiàn)代生物基因測序技術(shù)的發(fā)展，大量未知功能的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，研究這些基因的功能是當(dāng)前生物科學(xué)研究的主要方向之一。RNA干擾技術(shù)將大大促進(jìn)對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基敲除技術(shù)相比，RNA干擾技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。隨著對RNA干擾機(jī)制研究的不斷深入，RNA干擾技術(shù)將成為研究基因功能不可或缺的工具。

3.2 RNAi在基因治療方面的應(yīng)用RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等作用。因此RNAi可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。腫瘤的發(fā)生是多個(gè)基因相互調(diào)控作用“失靈”的結(jié)果，當(dāng)前對腫瘤的治療是通過物理和化學(xué)的方法抑制DAN復(fù)制及細(xì)胞分裂增殖，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞，然而這些方法不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長。而RNAi可以利用同一基因家族中多個(gè)成員具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一序列的dsRNA分子，只導(dǎo)入一種dsRNA即可以使多個(gè)基因同時(shí)沉默，從而捉使癌細(xì)胞生長停滯。

3.3 RNAi功能基因組研究上的應(yīng)用在功能基因組研究中，需要對特定基因進(jìn)行沉默使其功能喪失。利用RNAi高度序列專一性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出dsRNA可以特異地使特定基因沉默，從而使特定基因的功能喪失。因此RNAi可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。

總之，隨著RNA干擾機(jī)制研究的深入和完善，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，必將大力推動(dòng)人類疾病的治療和人類功能基因組學(xué)的發(fā)展。

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