A2780細胞染色體著絲粒點變異的研究

曹波

染色體著絲粒點（centromeric dots，Cd）分布于染色體著絲粒區(qū)，也被稱為動粒子，在借助一定的銀染方法的情況下可被染成黑色。染色體著絲粒點為一個三層盤狀結(jié)構(gòu)，主要構(gòu)成為蛋白質(zhì)成份和少量的著絲粒區(qū)DNA[1]。染色體Cd與染色體分離直接相關(guān)，它是細胞分裂中紡錘絲微管在染色體上的附著點。非整倍體形成的潛在根源之一可能為著絲粒區(qū)Cd缺失[2]，而染色體非整倍性畸變癌是細胞的顯著細胞遺傳學特征之一。細胞非整倍性畸變的原因為染色體在細胞分裂中不分離或錯誤分離。Vig在對腫瘤細胞染色體研究中采用過抗著絲粒點抗體免疫熒光技術(shù)，結(jié)果顯示其Cd缺失現(xiàn)象較為普遍，并闡述了造成其非整倍性畸變的新機制為腫瘤細胞染色體Cd缺失[3]。鑒于國內(nèi)外罕有相關(guān)報道，本研究中采用Cd-NOR同步銀染技術(shù)對人卵巢癌細胞A2780Cd變異進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 本研究選用的A2780細胞株來自四川大學華西醫(yī)學院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)的方法 將A2780細胞分瓶用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%新生牛血清）放置在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為飽和濕度、5%CO2、溫度為37℃，細胞處于對數(shù)生長期（備用）。

1.2.2 染色體的制備方法 首先將A2780細胞株經(jīng)傳代后培養(yǎng)48h，接著加入秋水仙素處理培養(yǎng)物6h。將培養(yǎng)液倒掉，采用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞3min、吸管輕輕吹打達到細胞脫壁的目的，然后采用轉(zhuǎn)速為1000r/min的離心機離心10min收集細胞。染色體制備按常用方法進行，在妊娠7～12周孕婦人工流產(chǎn)絨毛中取正常人胚胎絨毛組織，制備染色體標本采用直接法。

1.2.3 染色體的Cd-NOR同步銀染方法 首先將制備好的染色體標本放置于室溫下10～12d，接著按照Cd-NOR同步銀染技術(shù)的相關(guān)程序制作Cd帶標本。

1.2.4 Cd變異分析標準 Cd變異分為小Cd、Cd缺失、Cd遲滯復制或單Cd和Cd-NOR融合。正常狀態(tài)下，會有2個深染的圓形小體存在于一條中期染色體著絲粒區(qū)。小Cd為某條染色體Cd結(jié)構(gòu)與其他染色體Cd結(jié)構(gòu)相比形態(tài)小于1/2。Cd缺失為某條中期染色體著絲粒區(qū)看不到圓形小體或在著絲粒區(qū)邊緣只可以看到一個圓形小體。Cd遲滯復制或單Cd為有一個深染小體在著絲粒區(qū)正中央。Cd-NOR融合為染色體隨體區(qū)NOR處的銀染物質(zhì)與D、G組染色體中一條染色體的1個或2個Cd與混合在一起不能相互區(qū)分。如果上述情況之一是發(fā)生在n條染色體上，則計為n次（n≥2）。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，資料分析中多個樣本率差異的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義，兩個樣本率差異的比較用χ2分割法，以P≤0.05/2（K-1）=0.0125視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

本組中的A2780細胞是典型的非整倍性細胞群，其染色體數(shù)目變化最小的為10條，最多的為150多條，主要為50～70條。A2780細胞染色體Cd缺失率、Cd遲滯復制率、小Cd率和Cd-NOR融合率分別為1.41%、0.21%、1.48%和1.61%。A2780細胞Cd變異與人胚胎絨毛細胞染色體Cd變異比較的結(jié)果顯示：A2780細胞染色體Cd缺失率、Cd-NOR融合率明顯高于人胚胎絨毛細胞，χ2檢驗結(jié)果顯示兩組之間有明顯差異（P＜0.0125）；而小Cd率、Cd遲滯復制率兩者間沒有明顯差異。

3 討論

目前，醫(yī)學上對惡性腫瘤細胞染色體非整倍性畸變機制并不清楚，存在多種說法。Guimaraes GJ認為“著絲粒爆開”引起染色單體期外分離是其一個形成途徑[4]；Ren J等[5]認為的非整倍性畸變機制為：染色體Cd是紡錘體微管附著、運動和細胞周期監(jiān)控的重要結(jié)構(gòu)區(qū)，直接決定著染色體能否分離，沒有Cd結(jié)構(gòu)的染色體它的著絲粒功能就會失活，從而不能被紡錘絲附著，導致在分裂中期紡錘絲微管不能附著于染色體上和分裂后期染色體不能正常向兩極移動，就引起染色體不分離或錯誤分離，從而形成了非整倍性畸變。劉彥慧等[6]對一些非癌細胞染色體Cd變異的研究結(jié)果顯示：Cd缺失的中期染色體易于在分裂后期形成非整倍性畸變。本研究中對A2780細胞的染色體Cd分析結(jié)果顯示，惡性腫瘤細胞Cd缺失較為常見，而這種現(xiàn)象在非腫瘤細胞中很罕見。這一結(jié)果從深層次顯示在A2780細胞中存在高頻率的Cd缺失的可能相關(guān)因素為其非整倍性畸變。

“Cd-NOR融合”是李爽提出的一種新的細胞遺傳現(xiàn)象[7]，這一現(xiàn)象可能會對紡錘絲微管與Cd之間的聯(lián)系產(chǎn)生一定的干擾和阻礙作用，本組中A2780細胞染色體的Cd-NOR融合頻率顯著升高，這提示它可能是引起該癌細胞染色體非整倍性畸變的一種途徑。

Schliekelman M等[8]用其它方法在口腔癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)在細胞分裂過程中，Cd蛋白成份的缺陷會導致微管對染色體的捕獲失敗或造成排列障礙，進而引起染色體不分離、丟失或在中期和后期的遲滯，最終導致染色體非整倍性畸變。上述研究反映出染色體不分離風險的增加可能與染色體Cd結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，染色體Cd結(jié)構(gòu)改變最終會造成非整倍體的發(fā)生。Cd受特定基因控制合成，其結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)性復合結(jié)構(gòu)，所以那些能引起上述基因活性改變或基因突變的因素都可能導致Cd蛋白合成障礙而出現(xiàn)Cd結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象。某些癌細胞的非整倍性畸變可能僅涉及Cd變異的一種或幾種。目前，普遍認為誘發(fā)細胞非整倍性畸變的潛在因素就包括Cd缺失。癌細胞中高頻率的Cd缺失、Cd遲滯復制、小Cd和Cd-NOR融合表明Cd的這些變異可能是癌細胞非整倍性畸變產(chǎn)生的一種途徑。不是全部的非整倍體畸變都一定與Cd變異有關(guān)，可能還與其他如紡錘體異常、著絲粒爆開、染色單體遲滯分離等途徑有關(guān)。目前，還沒有確鑿證據(jù)證明Cd的這些變異為癌細胞一定出現(xiàn)的標記特征，但站在與染色體分離直接相關(guān)的Cd結(jié)構(gòu)角度來探索癌細胞非整倍性畸變機制是有意義的。

綜上所述，分析惡性腫瘤細胞進行染色體Cd結(jié)構(gòu)變化的具有一定的參考價值，其價值體現(xiàn)在染色體Cd變異分析可以用于腫瘤的早期診斷及預后的評估。

[1]SantaguidaS,MusacchiAo. The life and miracleso f kinetochreos[J].Nature Cell Biology,2009,16(10)：258-263.

[2]GanemN J,GodinhSoA ,PellmaDn A.Mechanilsimnk inge xtra cen rtosomes to chromosomal instability[J].Current Biology,2009,19(7)2：5.38-54

[3]劉彥軒，賈安奎.流產(chǎn)孕婦HBV-DNA含量與染色體著絲粒點變異研究[J].中國婦幼保健，2010，25(19)：2738-2740.

[4]GuimaraeGs J.Connectinwgi th Ska.a key complexa t the kine otchoremicrotubule interface[J].EMBO Journal,2009,28(10)：1375-1377.

[5]Ren J.MiCroKit 3.0：an integratedd atabaseo f midbody,censotrmoe and kinetochore[J].nucleic acids research,2010,38(8)：549-553.

[6]劉彥慧，黎麗芬，吳亞敏.抗病毒治療對CMV感染者血染色體著絲粒點的影響[J].醫(yī)學研究雜志，2008，20(12)：56-60.

[7]李爽，譚彬，劉學慶.SW626細胞染色體動粒變異對其染色體不穩(wěn)定的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2011，33(7)：667-670.

[8]SchliekelmaMn. ImpaireBdu b1F unctionIn vivo CompromisTeesn sion-DependenCth eckpoinFtu nctionL eadingt o Aneuploidayn d Tumoreignesis[J].cancer research,2009,69(1)：45-54.