新城疫病毒在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

李亞琳

（渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南714000）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科，能引起雞新城疫病?；贜DV對人的弱致病性以及在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的特點(diǎn)，NDV用于腫瘤治療逐漸得到關(guān)注［1］。早期研究主要為靜脈或瘤內(nèi)局部注射NDV及用NDV感染腫瘤細(xì)胞制成瘤苗進(jìn)行免疫治療。近年來，隨著RNA病毒基因工程操作的反向遺傳學(xué)技術(shù)的建立和完善，使人們可以在cDNA水平對病毒基因組進(jìn)行突變、缺失、顛換、轉(zhuǎn)位和互補(bǔ)等改造，并且可將外源基因插入到NDV基因組中，從而構(gòu)建重組NDV。目前，NDV作為一種潛在的腫瘤生物治療因子和新型病毒載體已經(jīng)廣泛的用于腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究。本文就NDV在腫瘤生物治療方面的研究及其抗腫瘤機(jī)制加以綜述。

1 NDV的直接溶瘤作用

1.1 NDV在腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制

NDV通過其表面的HN蛋白和宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體結(jié)合，從而吸附到宿主細(xì)胞表面。但是NDV能夠利用腫瘤細(xì)胞干擾素信號系統(tǒng)的缺陷，從而選擇性地在腫瘤細(xì)胞中高效復(fù)制。人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞屬于干擾素缺陷型的，NDV在這些人類腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制效率比正常細(xì)胞高出10 000倍［2］。Fiola C等［3］已闡明了 NDV 在腫瘤細(xì)胞選擇性復(fù)制的機(jī)制。NDV復(fù)制時，單鏈RNA復(fù)制形成雙鏈RNA，同時誘導(dǎo)細(xì)胞中蛋白激酶PKR的高表達(dá)，并激活干擾素信號通路，引起抗病毒反應(yīng)。而在腫瘤細(xì)胞中，蛋白激酶會延遲表達(dá)，病毒便逃避干擾素信號系統(tǒng)的監(jiān)控從而大量的復(fù)制。NDV特異感染雞是因?yàn)镻基因編碼的V蛋白可作為干擾素α／β的拮抗劑而破壞雞細(xì)胞中的干擾素信號系統(tǒng)，但在哺乳動物細(xì)胞中無此作用［4］。最新研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗凋亡蛋白也是NDV選擇在其中復(fù)制的原因之一［5］。

1.2 NDV的溶瘤機(jī)制

不同的NDV株在人腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制效力不同。溶瘤株病毒感染腫瘤細(xì)胞后，生成的子代病毒粒子的HN和F基因處于活化狀態(tài)，新生病毒可繼續(xù)感染鄰近細(xì)胞，因而具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性［6］。溶瘤株NDV在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制后，剝奪了腫瘤細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞表達(dá)受阻，代謝紊亂；另外還可以導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞之間發(fā)生融合，產(chǎn)生不能存活的合胞體，從而引起腫瘤細(xì)胞的快速、大量死亡。而非溶瘤株病毒產(chǎn)生的新生病毒顆粒無感染性，在腫瘤細(xì)胞只進(jìn)行單次復(fù)制，主要通過剝奪宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)而導(dǎo)致細(xì)胞慢速死亡。

研究發(fā)現(xiàn)，NDV可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。NDV通過活化腫瘤細(xì)胞內(nèi)部線粒體信號途徑，降低線粒體膜電位引起細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase－3和caspase－12而直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是一種p53非依賴的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力介導(dǎo)的凋亡通路［7－8］。有文獻(xiàn)報道在肺癌細(xì)胞中，caspase和p38MAPK同時參與NDV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］。另一研究發(fā)現(xiàn)凋亡因子的過表達(dá)也增加了NDV的溶瘤作用［10］。

此外，NDV感染腫瘤患者后，還通過免疫系統(tǒng)引起許多機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，間接地導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

1.3 腫瘤的溶瘤病毒治療

用NDV（F3aa）－GFP進(jìn)行的體內(nèi)外試驗(yàn)表明，這種病毒能夠溶解體外培養(yǎng)的頭頸癌腫瘤細(xì)胞系，并且抑制荷瘤鼠的腫瘤組織［11］。PV701是一株非重組的溶瘤NDV，已完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)，研究者通過脫敏和緩慢注射的方法增加注射劑量和次數(shù)，可以使注射劑量達(dá)到24～120×109pfu／m2（plaque forming units），并且可以在2周內(nèi)連續(xù)注射6次。19例結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等實(shí)體瘤患者中有6例顯示了一定的治療效果，生存期至少延長2年［12－13］。MTH－68／H 被用來直接靜脈注入患者體內(nèi)進(jìn)行多發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療，可以使患者的平均生存率從6個～12個月提高到5年～9年［14］。另一個研究報道了用MTH－68／H和口服丙戊酸聯(lián)合治療一名12歲男孩的多發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，發(fā)現(xiàn)在治療的開始有相當(dāng)明顯的抑制腫瘤作用，但隨后卻誘發(fā)了丘腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。繼續(xù)聯(lián)合使用MTH－68／H和口服丙戊酸使這種誘發(fā)的丘腦瘤得到控制，同時還通過免疫組化方法檢測到病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制［15］。2006年一篇有關(guān)NDV溶瘤病毒NDVHUJ株Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)的報道，將NDV病毒經(jīng)靜脈注射到惡性膠質(zhì)瘤患者體內(nèi)，并從起始0.1BIU～11BIU逐漸增加劑量，最后給予3次55BIU，結(jié)果在14列患者中5例有很微弱的發(fā)燒癥狀［16］。以上這些試驗(yàn)說明，一般情況下患者對NDV具有良好的耐受性，NDV基于它對人體的弱致病源性而作為腫瘤的生物抑制劑用于臨床。

2 腫瘤的NDV－ATV免疫治療

2.1 NDV－ATV抗腫瘤的免疫學(xué)機(jī)制

NDV修飾的自體腫瘤疫苗（NDV modified autologous tumor vaccine，NDV－ATV）是利用 NDV感染從患者腫瘤組織分離的細(xì)胞而制成疫苗，手術(shù)后再用這種疫苗對腫瘤患者進(jìn)行主動特異性免疫治療。NDV－ATV能夠通過以下幾種方式激活患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫防御系統(tǒng)［6］：①直接誘導(dǎo)腫瘤抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素以及單核細(xì)胞集落刺激因子等；②激活患者機(jī)體內(nèi)的免疫細(xì)胞，如腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，加強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤作用；③直接產(chǎn)生非特異性的細(xì)胞毒作用，增加腫瘤抗原的免疫原性，通過宿主免疫機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。人類腫瘤中只有B細(xì)胞淋巴瘤和部分黑色素瘤能夠表達(dá)共刺激分子，而其他大部分腫瘤因不能表達(dá)共刺激分子造成機(jī)體免疫耐受。但是接種NDV－ATV后，NDV的HN基因能夠在腫瘤細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞表面表達(dá)，并與這些細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激活性，激活腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞。

2.2 NDV－ATV免疫治療的研究與應(yīng)用

早期對溶瘤病毒的利用是在手術(shù)后用NDVATV對患者進(jìn)行主動特異性免疫的輔助治療。這種輔助治療明顯增加患者的免疫力和存活時間，而且負(fù)面效應(yīng)很小。Cassel WA等人在1992年報道了NDV溶瘤劑使用后，所有惡性黑素瘤病人手術(shù)后的存活期均超過10年，而且有60%的病人腫瘤不再復(fù)發(fā)，比以前報道的33%提高了很多。用NDV修飾的自體腫瘤疫苗聯(lián)合低劑量的細(xì)胞因子對208個重度腎癌病人進(jìn)行手術(shù)后的輔助治療，使病人手術(shù)后的存活率平均提高到21個月，疫苗使用后腫瘤的復(fù)發(fā)率降低到9%。最近，德國Schirrmacher V實(shí)驗(yàn)室用NDV－ATV治療頭頸鱗癌的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，手術(shù)后使用NDV－ATV的Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者的5年存活率提高到61%，而且用NDV－ATV注射后病人體內(nèi)的抗腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞可持續(xù)5年～7年。并認(rèn)為NDV－ATV主要通過激活機(jī)體內(nèi)在的免疫反應(yīng)以及抗腫瘤記憶性T細(xì)胞的CD4和CD8來抑制治療后殘留腫瘤細(xì)胞的惡性發(fā)展，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)，延長病人的存活時間［17］。

3 NDV為載體的腫瘤基因治療

3.1 NDV作為病毒載體的特點(diǎn)

基因治療被認(rèn)為是人類征服癌癥的潛在有效手段。腫瘤細(xì)胞復(fù)制型病毒載體即溶瘤病毒載體是新近發(fā)展起來的新型基因治療運(yùn)載系統(tǒng)。這種病毒載體能夠通過本身的復(fù)制擴(kuò)增所攜帶治療基因的表達(dá)水平，另外這種復(fù)制還可以直接影響宿主細(xì)胞的翻譯和轉(zhuǎn)錄過程而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡，繼而腫瘤相關(guān)抗原的釋放會引起溶瘤后的機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此以溶瘤病毒為載體的基因治療兼具溶瘤作用、外源性治療基因和抗腫瘤免疫反應(yīng)的綜合殺傷效果。

NDV作為新型溶瘤病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：①NDV屬于禽類病毒，對人類無致病性；②NDV為負(fù)鏈RNA病毒，不會和宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合，保證了宿主的遺傳穩(wěn)定性；③NDV天然的腫瘤細(xì)胞靶向復(fù)制，使其能夠在大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中高效復(fù)制而殺死腫瘤細(xì)胞［1］；④NDV和腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，能夠激活機(jī)體本身的免疫防御系統(tǒng)和腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，加強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力［18］；⑤利用反向遺傳學(xué)操作可以很容易地將外源性基因插入到NDV基因組中。

3.2 NDV的腫瘤基因治療研究

NDV作為基因治療載體正處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，目前的主要任務(wù)集中在通過基因工程構(gòu)建重組NDV，使其具有腫瘤靶向性。有研究表明NDV的HN基因上特定氨基酸殘基的不同是決定病毒抗原表位的一個因素［19］。Bian H 等［20－21］構(gòu)建了雙特異性 融 合 蛋 白 anti－HN／IL－2，其 一 端 為 抗 HN 的scFv，另一端為人IL－2。試驗(yàn) 表明，anti－HN／IL－2能將重組NDV－EGFP募集到IL－2受體陽性的淋巴瘤細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，增加了NDV的腫瘤靶向性，從而有效地殺死腫瘤細(xì)胞。將抗CD3和CD28的雙特異抗體偶聯(lián)到NDV上，用這種修飾的病毒作為載體進(jìn)行腫瘤的病毒治療，可以啟動人類淋巴細(xì)胞中強(qiáng)烈而持久的抗腫瘤效應(yīng)，增加了腫瘤的治療效果［22］。

3.3 NDV的安全性

NDV除了具有上述優(yōu)點(diǎn)外，因其RNA病毒的性質(zhì)以及溶瘤特點(diǎn)，使它在臨床試驗(yàn)和應(yīng)用上也顯示出一定的安全性。Schirrmacher V等［23］用NDVUlster感染人類腫瘤細(xì)胞制成NDV－STV腫瘤疫苗，并證明這種疫苗僅在注射位點(diǎn)的腫瘤局部進(jìn)行復(fù)制，沒有形成全身擴(kuò)散，不會影響宿主的基因組結(jié)構(gòu)，也不會在正常細(xì)胞中復(fù)制，對人類沒有感染性。PV701和 MTH－68／H的臨床應(yīng)用也證明了NDV在最大劑量范圍內(nèi)很少引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，僅僅出現(xiàn)的輕微發(fā)熱、過敏等癥狀基本上可以自愈［12－14］。NDV溶瘤病毒NDV－HUJ株用于多型性惡性膠質(zhì)瘤治療的Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)也證明了其臨床安全性，僅有30%的病人出現(xiàn)反應(yīng)性發(fā)燒癥狀［16］。正是因?yàn)镹DV在腫瘤治療中的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)和潛在的安全性，才使這種病毒在臨床上的試驗(yàn)越來越廣泛。

4 展望

隨著分子病毒學(xué)研究的深入，用復(fù)制型病毒代替非復(fù)制型病毒作為載體成為近年來基因治療的新方向，由于這類載體在感染靶細(xì)胞后，新生病毒粒子可繼續(xù)感染鄰近細(xì)胞，因而擴(kuò)增了外源基因轉(zhuǎn)染，有助于提高療效。NDV是一種天然的復(fù)制型溶瘤病毒載體，而且通過反向遺傳學(xué)使NDV攜帶外源基因的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，加上這種病毒在人體內(nèi)無致病性，操作起來比較安全，因此NDV是一種理想的用于腫瘤治療的溶瘤病毒基因治療載體。

雖然NDV作為病毒載體有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但也不可避免地存在一些缺點(diǎn)：①具有廣譜的細(xì)胞親嗜性。NDV雖可在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，但其HN蛋白也能夠和正常細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白親和而吸附在細(xì)胞表面，引起正常細(xì)胞的毒性作用，并且使最終結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞的病毒劑量減少；②引起機(jī)體的溶血作用。Bian H等研究發(fā)現(xiàn)NDV與小鼠或人紅細(xì)胞結(jié)合，能導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集和溶血作用［20－21］；③激活機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)。病毒感染引起的機(jī)體免疫反應(yīng)對后來病毒感染的抵制作用，阻礙了病毒溶瘤作用的反復(fù)性和徹底性。此外，病毒感染時形成的抗原－抗體復(fù)合物，還可能引起免疫變態(tài)反應(yīng)。因此NDV腫瘤治療研究需要解決兩個問題：①減小機(jī)體免疫防御系統(tǒng)對病毒在腫瘤內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散的影響；②賦予病毒靶向性，使病毒特異地和腫瘤細(xì)胞結(jié)合，而減少對正常細(xì)胞的毒性作用。

目前，NDV攜帶的外源性基因僅局限于報告基因和病毒蛋白，未見有攜帶治療基因的報道。因此，構(gòu)建具有功能性治療基因并具有腫瘤靶向性的重組病毒載體是未來NDV基因治療的發(fā)展方向。另外，Li Y L等［24］研究證明了NDV在活化的肝星狀細(xì)胞中也能高效復(fù)制，這個發(fā)現(xiàn)也為拓展NDV生物治療的范圍提供的理論基礎(chǔ)。

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