Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展＊

蘇曉蕊，岳 華，湯 承

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

目前，大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已被廣泛應(yīng)用于生物制品的生產(chǎn)和加工，這些產(chǎn)品主要用于疾病的診斷和治療。不同的細(xì)胞系對(duì)培養(yǎng)條件有特殊的要求，尤其是對(duì)培養(yǎng)基的成分。目前常用的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加一定濃度的動(dòng)物血清或其他動(dòng)物（人）源成分來維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。血清是體外細(xì)胞培養(yǎng)用得最多最廣的天然培養(yǎng)基，具有十分重要的作用，它能為細(xì)胞提供生存、生長(zhǎng)和增殖所必需的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞貼壁和鋪展的基質(zhì)成分、載體蛋白、中和毒性的物質(zhì)、為培養(yǎng)液提供很好的緩沖體系及蛋白酶抑制劑等[1]。但是從培養(yǎng)基的安全性和穩(wěn)定性考慮，傳統(tǒng)的培養(yǎng)基還是有一些缺陷。由于血清所含的化學(xué)成分不確定，每個(gè)批次之間也存在著差異，同時(shí)血清的價(jià)格昂貴，還容易引起細(xì)菌、真菌、病毒和支原體污染[2]。此外，血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)會(huì)給疫苗、細(xì)胞因子和單克隆抗體等生物制品的分離純化帶來很大的困難，而且這些蛋白質(zhì)在生物制品的說明書中還要標(biāo)明[3]。所以，無血清和無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基是生物制品發(fā)展的必然方向。

無血清培養(yǎng)基是不含血清，但含有動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基。無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基，它們的化學(xué)成分明確、質(zhì)量均一且蛋白質(zhì)含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性，并減少了后期純化工藝。生產(chǎn)過程中還可以通過無血清培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，使不同的細(xì)胞能各自在最有利于其生長(zhǎng)或最有利于表達(dá)的目的產(chǎn)物的環(huán)境中持續(xù)高密度培養(yǎng)。Vero細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織和我國(guó)生物制品規(guī)程認(rèn)可的生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞系。與用作疫苗生產(chǎn)的其他細(xì)胞基質(zhì)相比，Vero細(xì)胞的來源方便，生物安全性高，對(duì)多種病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高，是很多病毒理想的基質(zhì)，能廣泛的用于人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)[4－8]。鑒于以上原因，Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，無血清培養(yǎng)的技術(shù)關(guān)鍵在于培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。本文對(duì)Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的組成

無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加因子兩大部分組成。不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加因子的種類和濃度是不同的，具體試驗(yàn)過程中要根據(jù)需要優(yōu)化。

1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最重要的營(yíng)養(yǎng)成分是葡萄糖和谷氨酰胺。葡萄糖是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖以及產(chǎn)物表達(dá)過程中重要的能量來源。谷氨酰胺是最初的氮源，同時(shí)也是碳和能量來源，它還為細(xì)胞提供蛋白質(zhì)和氨基酸的胞內(nèi)前體物質(zhì)，細(xì)胞所需能量的30%～65%都來自于谷氨酰胺的代謝[9]。但是過高濃度的葡萄糖和谷氨酰胺會(huì)引起培養(yǎng)基中乳酸及氨等代謝產(chǎn)物的堆積而損害細(xì)胞。Petiot E等[10]通過對(duì)Vero細(xì)胞在無血清培養(yǎng)過程中的中心代謝研究，證明了葡萄糖主要參與糖代謝，谷氨酰胺是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）最主要的碳源，天冬酰胺和丙酮酸鈉可以代替谷氨酰胺作為碳源，從而減少乳酸鹽和氨氣等次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的危害。谷氨酰胺容易降解，在新配制的培養(yǎng)基中要重新添加與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中相同的量。

目前，Vero細(xì)胞常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有 M199、DMEM和F12。陳昭烈等[11]以 DMEM∶F12（1∶1）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研制出一種用于Vero細(xì)胞微載體培養(yǎng)的無動(dòng)物來源成分無血清培養(yǎng)基專利，這種培養(yǎng)基無論是在細(xì)胞形態(tài)還是細(xì)胞的活力方面都能達(dá)到含100mL／L血清培養(yǎng)基的效果；Rourou S等[12]利用 M199作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基研制出一種Vero細(xì)胞無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基，細(xì)胞在這種培養(yǎng)基下經(jīng)過10次傳代后，生長(zhǎng)速率和分裂指數(shù)都能達(dá)到含血清培養(yǎng)基的效果。不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基含的營(yíng)養(yǎng)成分不同，所以選擇添加因子和優(yōu)化添加因子的濃度就成為了無血清培養(yǎng)基研制的重要環(huán)節(jié)。

1.2 主要添加因子

添加因子是無血清培養(yǎng)基中血清替代成分的總稱，它們的種類繁多，主要包括生物大分子、小分子化學(xué)物質(zhì)和微量元素。根據(jù)它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)中的作用可以分為4類。

1.2.1 蛋白質(zhì)類 在Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)的研究初期，主要是采用添加牛（人）血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白來達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。血清白蛋白不但有調(diào)節(jié)滲透壓，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷的作用，它還能通過與維生素、脂類、激素、金屬離子和生長(zhǎng)因子的結(jié)合，從而穩(wěn)定和調(diào)節(jié)這些物質(zhì)在無血清培養(yǎng)中的活性。此外，它還有結(jié)合毒素和減輕蛋白酶對(duì)細(xì)胞影響的作用。新的研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)選用植物水解蛋白替代血清白蛋白，這種蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，主要包括氨基酸、寡肽類、紫錐菊多酚和纖維[13]。目前最常用的植物水解蛋白有大豆植物水解蛋白，小麥植物水解蛋白和水稻植物水解蛋白[14]。這些植物來源的蛋白質(zhì)，使疫苗的生產(chǎn)過程更安全。轉(zhuǎn)鐵蛋白是細(xì)胞無血清培養(yǎng)最重要的添加成分，它的缺失可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。另外，它還是一些有害微量元素的螯合劑。有資料顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白可以被某些鐵螯合劑所代替，常用的螯合劑為Fe3＋－硫酸酯－亞氨基二乙酸（Fe3＋－sulfateiminodiacetic acid，IDA）復(fù)合物、Fe3＋－硫酸酯－甘氨酰甘氨酸（Fe3＋－sulfate－glycylglycine，gly－gly）復(fù)合物。與IDA相比，gly－gly結(jié)合鐵的能力較低，因而它的應(yīng)用受到一定的限制。Rourou S等[12]2009年在研究Vero細(xì)胞無動(dòng)物源成分培養(yǎng)基時(shí)認(rèn)為檸檬酸鐵和維生素C混合使用可以替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，使用濃度為100μmol／L。Zhang J[15]在 NSO細(xì)胞的無血清培養(yǎng)中成功的運(yùn)用托酚酮和檸檬酸鐵銨代替轉(zhuǎn)鐵蛋白。Landauer K等[16]的研究表明，在工業(yè)化生長(zhǎng)條件下，培養(yǎng)CHO細(xì)胞時(shí)，檸檬酸鐵的濃度在缺少調(diào)和生長(zhǎng)因子的無蛋白培養(yǎng)基中對(duì)提高細(xì)胞的黏附至關(guān)重要。這些研究成果為我們尋求轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品提供了參考。

1.2.2 激素和生長(zhǎng)因子 胰島素是多種細(xì)胞生長(zhǎng)所需的關(guān)鍵成分，它能夠刺激尿苷和葡萄糖攝取，促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂類的合成，增加脂肪酸和糖原的濃度[17]，在很多的低血清和無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中都要添加。但是Rourou S等[12]認(rèn)為胰島素在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中可以去除，這種報(bào)道目前來看有待進(jìn)一步的研究。

此外，Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)還需要一定量的其他激素，如多肽類激素中的生長(zhǎng)素、胰高血糖素、甲狀腺素等以及甾類激素中的孕酮、氫化可的松和雌二醇等。在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)過程中，研究者常常加入皮質(zhì)醇等激素來優(yōu)化培養(yǎng)基成分。

生長(zhǎng)因子是維持細(xì)胞體外生存、增殖和分化所必須的補(bǔ)充因子。它是有效的促有絲分裂原，能縮短細(xì)胞群體的倍增時(shí)間。在Vero細(xì)胞的無血清培養(yǎng)中，常用的細(xì)胞生長(zhǎng)因子是EGF和FGF。Clark JM等[18]在研究微載體無血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)認(rèn)為EGF更能夠促進(jìn)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞產(chǎn)量增加10%～15%，濃度為100μg／L，這與 Rourou S等[12]報(bào)道的結(jié)果一致。但是，一些報(bào)道認(rèn)為FGF在Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)中作用更重要。但是現(xiàn)有的研究成果顯示，EGF的使用頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于FGF。

1.2.3 促貼壁因子 絕大多數(shù)的真核細(xì)胞都是貼壁依賴性細(xì)胞，這就要求無血清培養(yǎng)基中添加促貼壁因子。常規(guī)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)依賴的是血清中含的纖連蛋白、膠原蛋白和多聚賴氨酸等成分，這些因子除具有促進(jìn)細(xì)胞貼壁延伸的作用外，還能促進(jìn)細(xì)胞的分化。目前常用化合物來代替血清中的促貼壁成分，如明膠、teleostean等。在 Rourou S等[12]研究中，在沒有添加促貼壁因子時(shí)，細(xì)胞聚集成團(tuán)，分布不均勻。而在培養(yǎng)瓶上包被一層teleostean，則細(xì)胞貼壁良好，分裂指數(shù)也與適應(yīng)100mL／L血清培養(yǎng)的Vero細(xì)胞差別不顯著。這表明，在貼壁細(xì)胞的無血清培養(yǎng)研制中，選擇合適的促貼壁因子促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)是很重要的。

1.2.4 微量元素 在Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中常添加的微量元素是亞硒酸鈉，另外常添加的微量元素還有鋅。硒是宿主免疫應(yīng)答和抗氧化過程中非常重要的微量元素，它以硒代半胱氨酸的形式參與谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶的作用過程，消除氧化物酶和氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害。Verma S等[19]在2008年研究體外培養(yǎng)硒的缺乏對(duì)西尼羅病毒的增殖和致細(xì)胞病變的影響時(shí)報(bào)道，硒的缺乏能夠影響細(xì)胞活力、谷胱甘肽過氧化酶的表達(dá)和增加西尼羅河病毒感染后的細(xì)胞病變，但這并不能說硒是通過限制氧化應(yīng)激平衡細(xì)胞生死的重要元素。有報(bào)道稱硒還能防止細(xì)胞的光照損傷。亞硒酸鈉的最適添加濃度是20nmol／L～50nmol／L。細(xì)胞無血清培養(yǎng)還要解決由于血清的缺乏而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，Zn離子和金精三羧酸（aurintricarboxylic acid，ATA）有抑制細(xì)胞凋亡的作用，因此在Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中也要添加。

1.2.5 維生素 維生素是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用。在Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中常添加維生素C、維生素E和生物素。維生素C和維生素E具有抗氧化作用；生物素是一些特異羧化酶的組成部分，參與糖代謝和脂肪酸的合成過程。

1.2.6 其他添加因子 在現(xiàn)有的關(guān)于Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的報(bào)道中，幾乎都添加了乙醇胺，它作為一種還原劑，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜[12]。另外，也有的在培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉和β－巰基乙醇。丙酮酸鈉是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物，可以為細(xì)胞增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[10]。β－巰基乙醇可以改善細(xì)胞的存活率[20]。

2 展望

隨著現(xiàn)代細(xì)胞工程的發(fā)展，利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞作為基質(zhì)生產(chǎn)疫苗的應(yīng)用越來越廣泛。市場(chǎng)上商品化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基主要是無血清培養(yǎng)基和無血清無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基盡管能夠維持細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)和增殖，但仍存在外來污染的可能，使疫苗安全性存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，適合Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的無血清無動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基是目前常用的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基利用植物或酵母水解蛋白和重組蛋白替代動(dòng)物源蛋白質(zhì)，有效地提高了疫苗的安全性；也可以用氨基酸或多肽片段代替蛋白質(zhì)。但是一些添加因子的價(jià)格昂貴，與含血清培養(yǎng)基相比增加了成本。因此，如何降低生產(chǎn)成本，是Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基今后的一個(gè)重要研究方向。此外，由于生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)以及發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)Vero細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，增加細(xì)胞的濃度，提高病毒的產(chǎn)量，所以適應(yīng)這兩種培養(yǎng)技術(shù)的無血清培養(yǎng)基是今后一段時(shí)期細(xì)胞工程產(chǎn)品生產(chǎn)和研制的重要發(fā)展目標(biāo)，并且在病毒疫苗的生產(chǎn)上有了一定的應(yīng)用[21－24]。

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