牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法的建立

劉 凱，劉忠清，李文德

（1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩850030；2.西藏出入境檢驗檢疫局，西藏拉薩850001）

牛出血性敗血癥（Bovine haemorrhagic septicaemia），臨床上簡稱為“牛出敗”，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）引起的主要以高熱、肺炎、急性胃腸炎以及內(nèi)臟廣泛性出血為特征的急性、熱性傳染病。該病呈地方性流行或散發(fā)，水牛、耗牛、綿羊有時呈地方性流行，常局限于一定的地區(qū)，我國各地都有發(fā)病報道，其中西藏發(fā)病率和病死率都很高，牦牛病死率在30%以上，幼畜病死率在80%以上。發(fā)病季節(jié)不明顯，但以冷熱交替、氣候驟變、濕熱多雨時多發(fā)。該病的致病菌存在于病畜的全身各組織、體液、分泌物及排泄物中，主要經(jīng)口或呼吸道（飛沫）感染。耐過動物可成為帶菌動物，是本病的傳染源之一。健康牛只主要通過與病牛直接接觸或通過被本菌污染的墊草、飼料、飲水而感染。本病的發(fā)生與環(huán)境、機(jī)體的狀態(tài)、病菌的血清型及毒力等都有著密切關(guān)系。寒冷、悶熱、潮濕擁擠、通風(fēng)不良、疲勞運輸、突然更換飼料或營養(yǎng)缺乏等不良因素均可誘發(fā)本病。

目前，對牛出血性敗血癥的診斷主要根據(jù)流行特點、臨床癥狀和剖檢變化做出初步診斷，確診需要進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查和小鼠感染驗證等方法。在這些方法中，流行特點、臨床癥狀和剖檢存在的缺點是需要收集的資料多、工作復(fù)雜繁重、易造成污染，診斷誤差大，還難以與炭疽、氣腫疽、惡性水腫、牛肺疫等病相區(qū)別。而細(xì)菌學(xué)檢查和小鼠感染驗證方法除了工作復(fù)雜繁重外，還需要具備一定的儀器設(shè)備和條件，且所需時間長，在我區(qū)基層畜牧獸醫(yī)部門難以開展。免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展的一種快速檢測技術(shù)，雖然它的敏感性和特異性均不如PCR和ELISA高，但是，它具有不需要儀器、檢測快速、操作簡單、適合現(xiàn)場檢查等優(yōu)點，在傳染病的快速診斷方面顯示出很好的應(yīng)用前景，非常適合于基層獸醫(yī)和相關(guān)技術(shù)人員、農(nóng)牧民群眾對動物疾病的診斷。因此，結(jié)合相關(guān)技術(shù)，我們開展了牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法的研究探索。

1 材料與方法

1.1 材料

多殺性巴氏桿菌由西藏自治區(qū)生物制藥廠提供；牛副結(jié)核病、炭疽病、牛結(jié)核、口蹄疫陽性血清為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)。樣本病料由西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院采自經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢驗均為陽性牛出血性敗血癥的西藏那區(qū)、拉薩牦牛養(yǎng)殖戶病牛，并保存；牛出血性敗血癥抗體由西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院制備，由上海杰一生物技術(shù)有限公司純化。

主要試劑為西藏大地儀器設(shè)備公司和上海精閔商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸收墊均為上海杰一生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗體的制備與純化 將多殺性巴氏桿菌接種在全血馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h～24 h，用滅菌生理鹽水洗下培養(yǎng)菌后計數(shù)，然后用滅菌生理鹽水將菌液稀釋至2×1014個細(xì)菌／L。加入50 mL／L的甲醛滅活24 h，滅活期間振蕩數(shù)次，滅活后菌液經(jīng)細(xì)菌檢驗沒有活性后4℃保存。并用其液同時同劑量免疫A、B兩只青年雄性家兔，每隔5 d免疫1次，共免疫5次，每次劑量分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，肌肉多點注射，最后1次免疫后7 d經(jīng)測試合格后分別從頸動脈放血，分離血清，分別采用辛酸－硫酸銨法粗提、H－i Trap Protein GHP親和層析法純化，用紫外分光光度計測定提純抗體的濃度并調(diào)整至1 mg／mL，分裝并命名為名為兔抗巴氏桿菌IgG－A和兔抗巴氏桿菌Ig G－B，置－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金溶液的制備 取300 mL潔凈硅化三角瓶一個，向內(nèi)加99 mL去離子雙蒸水和1 mL 10 mL／L氯金酸，加熱煮沸，在磁力攪拌下快速準(zhǔn)確加入10 g／L檸檬酸三鈉1.5 mL，煮沸至溶液變?yōu)槌燃t色，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后用去離子雙蒸水恢復(fù)到原體積，最后置于潔凈的棕色瓶中4℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H確定 取若干個1.5 mL離心管，分別加入1 mL上述制備的膠體金溶液，用0.2 mol／L K2CO3將p H分別調(diào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。取50μL 1 mg／mL 的兔抗巴氏桿菌IgG－A加入上述膠體金管中，震蕩20 min后室溫放置10 min，然后每管分別加入100μL 100 g／L NaCl溶液，繼續(xù)震蕩混合10 min后室溫下放置10 min；觀察膠體金溶液顏色變化，記錄保持紅色的最低p H（X）。再按上述方法將p H調(diào)為梯度為X－1.0；X－0.8；X－0.6；X－0.4；X－0.2；X；X＋0.2；X＋0.4；X＋0.6；X＋0.8；X＋1.0；X＋1.2重復(fù)上述試驗。記錄仍保持紅色的最低p H，即為最佳p H。

1.2.4 抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度確定 首先取若干個1.5 mL離心管，分別加入抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H的膠體金溶液1 mL，然后各管依次分別加入梯度為其濃度達(dá)到每毫升中含有抗體1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg的兔抗巴氏桿菌IgG－A，震蕩混合20 min后室溫下放置10 min，然后每管分別加入100μL 100 g／L NaCl溶液，繼續(xù)震蕩混合10 min后室溫下放置10 min。顏色仍保持紅色的最小抗體用量即為抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度。

1.2.5 免疫膠體金溶液的制備 取一個20 mL的潔凈試管，加入需制備量的膠體金溶液，0.2 mol／L K2CO3將p H調(diào)整為抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H值，根據(jù)抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度和要標(biāo)記的膠體金的總量計算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量，逐滴加入兔抗巴氏桿菌IgG－A于膠體金溶液中，搖勻15 min，室溫放置10 min～15 min，加入100 mL／L BSA 至終濃度為50 mL／L，再繼續(xù)攪拌15 min，防止抗體蛋白和膠體金聚合和沉淀，最后置于4℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 免疫層析檢測條的制備 試紙條由下至上依次由樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、NC膜和吸水墊4個部分組成，具體組裝過程如下：將兔抗巴氏桿菌IgG－A膠體金溶液噴在玻璃纖維膜上，將兔抗巴氏桿菌IgG－B和羊抗兔抗體分別噴在硝酸纖維膜檢測線（T）區(qū)和對照線（C）區(qū)的相應(yīng)位置上，冷冰風(fēng)干備用，把試紙條各組分按順序分別貼附在黏性PVC底板的相應(yīng)位置上：樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、吸水紙，然后切割成4 mm寬的紙條，裝入一個特制的塑料卡內(nèi)，放入鋁箔袋內(nèi)，再裝入干燥劑后密封，置于4℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 試紙條的臨床檢測

1.2.7.1 用法 撕開鋁箔袋，將試紙條檢測卡平放，取待檢液1～2滴加入到加樣孔內(nèi)，在室溫內(nèi)靜置5 min～10 min后觀察結(jié)果。

1.2.7.2 結(jié)果判定 檢測線（T）和區(qū)對照線（C）各出現(xiàn)一條顏色較深的在紫紅色線為陽性；在檢測線（T）處出現(xiàn)一條顏色很淺的紫紅色線，而對照線（C）出現(xiàn)一條紫紅色線判為弱陽性；檢測線（T）處不出現(xiàn)色線，對照線（C）出現(xiàn)一條紫紅色線判為陰性；在對照線（C）不出現(xiàn)色線的均為失效。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液的制備

用上述方法制備的膠體金溶液，經(jīng)紫外分光光度計檢測，得知膠體金顆粒直徑約為30 nm。

2.2 抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H確定

用上述方法得出的最佳p H為8.8。

2.3 抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度確定

用上述方法測得顏色仍保持紅色的最小抗體用量為30μg／mL。即為抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度是30μg／mL。

2.4 特異性試驗

用上述條件制備的牛出血性敗血癥膠體金免疫層試紙條，檢測10例陽性牛出血性敗血癥病料，結(jié)果均顯示陽性反應(yīng)。而用同樣試紙條同時對牛副結(jié)核病、炭疽病、牛結(jié)核、口蹄疫陽性抗原分別檢測，結(jié)果均為陰性，顯示均無交叉反應(yīng)。且都在5 min～10 min內(nèi)顯示結(jié)果。

2.5 穩(wěn)定性試驗

將制備的牛出血性敗血癥膠體金免疫層試紙條分別放置4℃冰箱和37℃培養(yǎng)箱中，每隔10 d各取5條，分別檢測陽性牛出血性敗血癥病料和牛副結(jié)核病、炭疽病、牛結(jié)核、口蹄疫陽性任一種抗原，共檢查2月，結(jié)果無異常變化。

2.6 試紙條的臨床檢測

在臨床實踐中，對細(xì)菌檢查為陽性的59例牛出血性敗血癥病料用制備的牛出血性敗血癥膠體金免疫層試紙條進(jìn)行檢測，均在5 min～10 min內(nèi)顯示為陽性結(jié)果。對147頭健康牛檢測均為陰性，符合率達(dá)到100%。說明試紙條具有細(xì)菌檢測同樣的效果。

3 討論

在制備膠體金溶液、確定試驗抗體與膠體金結(jié)合的最佳p H和抗體與膠體金結(jié)合的最佳濃度時，要嚴(yán)格按照技術(shù)操作規(guī)程進(jìn)行；在試紙條噴涂和組裝過程中，環(huán)境濕度不應(yīng)超過40%，否則制備的試紙條容易失效。

以膠體金免疫層技術(shù)在牛出血性敗血癥定性診斷上還是首次嘗試，目前國內(nèi)外尚未見報道，而以抗原為診斷目標(biāo)的檢查動物疾病的報道也很少。用本文方法建立的牛出血性敗血癥膠體金免疫層試紙條，檢測樣本用量少，只需不到1 mL就可以了，同時檢測方法簡單、快速、特異性和穩(wěn)定性強(qiáng)，只需5 min～10 min就可用肉眼觀察并判斷結(jié)果，不需專業(yè)的人員及特殊的設(shè)備，檢測費用低。因此，特別適合基層獸醫(yī)和動物檢疫工作人員、基層養(yǎng)殖戶等人員進(jìn)行現(xiàn)場檢測或診斷。所以，該技術(shù)具有廣闊的市場和應(yīng)用前景。

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