禽滑液囊支原體研究進(jìn)展

曹中贊，欒新紅，劉勝旺，何劍斌

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150001）

支原體（Mycoplasma）也稱霉形體，是一類沒有細(xì)胞壁的原核生物，屬于軟膜體綱，霉形體目霉形體科。雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）和滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是兩種重要的家禽病原。MS能夠感染雞和火雞，引起上呼吸道疾病、傳染性滑膜炎和黏液囊炎的發(fā)生，降低產(chǎn)蛋量、蛋品質(zhì)以及孵化率，導(dǎo)致生長遲緩和飼料轉(zhuǎn)化率降低，降低屠宰時(shí)胴體質(zhì)量，使屠體廢棄率升高［1］，給全球家禽工業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本文就目前MS的流行情況、致病機(jī)制、診斷方法以及防控措施等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，以期更好地檢測、診斷、凈化和防控禽滑液囊支原體病。

1 滑液囊支原體流行病學(xué)概況

MS一年四季均可發(fā)生，但冬春季節(jié)易發(fā)。各種日齡雞只均易感，尤以雛雞最為嚴(yán)重。禽對(duì)MS感染的抵抗力隨年齡的增長而加強(qiáng)。病禽和隱性感染禽是本病的傳染源?？梢越?jīng)種蛋垂直傳播，也可通過人員、野鳥、飲水、墊料等進(jìn)行直接或間接的水平傳播。飼養(yǎng)管理水平差，生物安全措施不完善，不良環(huán)境因素是導(dǎo)致MS感染流行的主要因素。

MS感染能夠給商品肉雞帶來全身性的損傷，包括黏液囊、肝、脾、腦、眼膜和骨骼肌等，引起氣囊炎和上呼吸道疾病，以及關(guān)節(jié)炎和傳染性滑膜炎的發(fā)生，導(dǎo)致屠宰時(shí)胴體廢棄率上升，甚至?xí)ぐl(fā)免疫系統(tǒng)的抑制［2］。MS感染能夠使產(chǎn)蛋雞群的產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋品質(zhì)受到損失。Gole V C等［3］應(yīng)用 ELISA檢測蛋黃抗體的方法對(duì)隨機(jī)挑選的19個(gè)澳大利亞商品蛋雞群進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，MS抗體陽性率高達(dá)69%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明MS血清學(xué)狀態(tài)和一些蛋品質(zhì)參數(shù)如透明度、蛋殼破裂強(qiáng)度、蛋殼反射率和畸形率有一定的相關(guān)性。Feberwee A 等［4－5］研 究 表明，MS感染能夠使商品蛋雞群和肉種雞群的產(chǎn)蛋率降 低、蛋 殼 尖 端 缺 陷 （eggshell apex abnormalities，EAA）發(fā)生率升高。這種影響在意大利的產(chǎn)蛋雞群中也被監(jiān)測到［6］。

MS在種用雞群和商品代雞群的流行情況不同。多個(gè)國家的流行病學(xué)監(jiān)測表明MS在商品代雞群中有很高的流行率。Hagan等在英國隨機(jī)檢測了56個(gè)農(nóng)場的卵黃抗體樣品，有78.6%的農(nóng)場抗體陽性。Dufour－Gesbert F等［7］從超過60日齡的法國某蛋雞群里分離培養(yǎng)了53份樣品，其中有36份是MS陽性（68%）。Xavier J等［8］對(duì)阿根廷2003年1月至5月、2004年12月至2005年4月兩個(gè)時(shí)期的庭院養(yǎng)雞的2 441份血清樣品進(jìn)行了MS血清流行病學(xué)監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)時(shí)期的MS血清抗體陽性率分別為68.6%和100%。而祖代和父母代種雞場情況則不同，F(xiàn)eberwee A等［9］在2005年至2006年對(duì)荷蘭一些商業(yè)雞場進(jìn)行了12個(gè)月MS血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋雞和肉雞的祖代雞群MS血清陽性率分別為0和10%，蛋雞和肉雞的父母代雞群陽性率分別為25%和35%，商品蛋雞群和商品肉雞群的陽性率分別為50%和73%。由此可以看出，祖代和父母代種雞場由于有著高水平生物安全措施的實(shí)施，以及嚴(yán)格的接觸傳播控制和地理區(qū)域隔離，使得MS的血清陽性率低于商品代雞群。

MS目前在我國還沒有廣泛的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但已有從河南、陜西、北京、廣東、廣西、呼和浩特和上海等地區(qū)分離到 MS的報(bào)道［10］。血清學(xué)調(diào)查表明國內(nèi)多個(gè)地區(qū)雞群中存在MS感染［11］。

2 滑液囊支原體致病機(jī)理

支原體是最小的自我復(fù)制的微生物，有著非常小的基因組和蛋白質(zhì)組。支原體與宿主的相互作用主要反映在膜蛋白上，膜蛋白負(fù)責(zé)黏附宿主細(xì)胞，而且是宿主免疫應(yīng)答的主要目標(biāo)。在MS方面研究較多的膜蛋白是可變脂蛋白及血凝素蛋白（variable lipoprotein haemagglutinin，Vlh A）［12］。Vlh A 蛋白在介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞以及免疫逃避方面扮演重要角色。Vlh A蛋白經(jīng)過翻譯后切割產(chǎn)生氨基端部分（脂蛋白 MSPB）和羧基端部分（MSPA）。MSPA和MSPB都是表面暴露蛋白，具有高頻率的抗原變異性［13］。5′Vlh A基因區(qū)編碼富含脯氨酸的重復(fù)區(qū)，在不同MS株之間是高度多態(tài)性的，這個(gè)區(qū)域的插入和缺失能導(dǎo)致不同MS株的MSPB長度發(fā)生變化，此外，5′Vlh A基因區(qū)和基因組假基因的重組能導(dǎo)致MSPB羧基端2／3區(qū)，以及MSPA中的抗原決定簇發(fā)生改變，在不同MS株的MSPA蛋白上有著明顯的抗原差異［14］。迄今為止，只有MSPA被發(fā)現(xiàn)在介導(dǎo)黏附宿主細(xì)胞、以及MS感染的發(fā)病機(jī)理方面有著重要作用。而富含脯氨酸多肽具有免疫調(diào)節(jié)和加強(qiáng)抗體應(yīng)答的效果，推測MSPB可能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在MS免疫逃避中有著一定作用［15］。

MS通過MSPA與宿主黏膜表面的受體相結(jié)合是其感染宿主細(xì)胞的第一步，由于MS簡化的基因組和有限的生物合成能力，需要從宿主那里獲得膽固醇、氨基酸、脂肪酸、維生素、核酸等其他營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而生長繁殖，這一過程可能引起宿主細(xì)胞損傷。而MS細(xì)胞內(nèi)所含的各種外毒素或內(nèi)毒素，如神經(jīng)氨酸酶、過氧化氫酶、卵磷脂酶等酶類以及其自身自然代謝產(chǎn)物，可引起宿主細(xì)胞損傷或死亡。

3 MS診斷方法

控制和清除支原體依賴于準(zhǔn)確及時(shí)地對(duì)感染群體做出診斷。高度敏感、準(zhǔn)確、快速的診斷方法對(duì)MS的監(jiān)測，最終建立無MS感染禽群是必須的。MS的診斷方法包括病原的培養(yǎng)和分離鑒定、血清學(xué)診斷以及分子生物學(xué)方法。

3.1 病原培養(yǎng)分離

支原體培養(yǎng)和分離鑒定作為準(zhǔn)確診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是最可靠最經(jīng)典的診斷方法，常用來進(jìn)行血清學(xué)陽性樣本的確認(rèn)。但存在勞動(dòng)量大、浪費(fèi)時(shí)間的缺點(diǎn)。尤其在多種支原體以及其他細(xì)菌混合感染的情況下，它們的分離培養(yǎng)是非常費(fèi)時(shí)和有難度，而且陽性結(jié)果的獲得，通常需要4 d～7 d，甚至30 d。

3.2 血清學(xué)檢測方法

最常用的血清學(xué)檢測方法包括血清平板凝聚試驗(yàn)（serum plate agglutination，SPA），血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI），以及酶聯(lián)免疫吸附 試 驗(yàn) （enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）。血清平板凝聚試驗(yàn)主要是檢測血清中的Ig M抗體，Ig M一般是感染后3 d～5 d出現(xiàn)，持續(xù)70 d～80 d［8］。該技術(shù)快速，方便，在生產(chǎn)上應(yīng)用較多，但由于禽群滅活疫苗的使用、污染的血清以及交叉反應(yīng)，該方法容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)是一種操作簡易的血清學(xué)技術(shù)，主要檢測血清中Ig G抗體，具有特異、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性差。IgG抗體一般在感染后10 d才出現(xiàn)，該方法不適用于MS感染的早期診斷。此外，該法耗時(shí)較長，在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用受到一定限制。MS和MG（Mycoplasma gallisepticum）在血凝抑制試驗(yàn)中沒有交叉反應(yīng)，這有助于 MG和MS感染的區(qū)分。ELISA做為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）檢疫規(guī)范收錄的MS檢測技術(shù)，是一種快速敏感的血清免疫學(xué)診斷技術(shù)，為大量樣本的檢測提供了技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)除可用于檢測MS感染雞血清中的抗體水平，還可用于蛋黃中抗體的檢測。蛋黃樣本的檢測避免了血清樣本的昂貴，血樣采集對(duì)宿主造成的應(yīng)激，人員的培訓(xùn)等弊端。Hagan J C 等［16］對(duì)蛋黃樣本的ELISA檢測技術(shù)進(jìn)行了評(píng)估，認(rèn)為用氯仿提取卵黃抗體進(jìn)行ELISA檢測是適合產(chǎn)蛋雞群MS監(jiān)測的一種有效方法。為解決ELISA用于MS檢測特異性不強(qiáng)的問題，多位學(xué)者對(duì)用于ELISA的包被抗原進(jìn)行了研究，早期用于檢測抗體的MS抗原多是一些粗制的、難以確定的膜組份，后來Noormohammad A H 等［17］用 MS代表株 WVU 1853的重組脂蛋白（r MSPB）作為包被抗原，建立了檢測不同株MS抗體的間接ELISA方法，增強(qiáng)了敏感性和特異性。

隨著技術(shù)的發(fā)展一些先進(jìn)的的血清免疫學(xué)方法不斷被研制出來，Oh K等［18］用 MSPA作為抗原，基于表面等離子體共振成像（SPRi）的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)來檢測雞血清中的MS抗體，這種不用標(biāo)記的高通量方法比ELSIA更可靠，更節(jié)省時(shí)間。但是，世界衛(wèi)生組織僅把血清學(xué)檢測方法推薦為在群體中進(jìn)行禽支原體篩選監(jiān)測的工具，而不是個(gè)體診斷的工具。這是因?yàn)檫@些血清學(xué)檢測方法有著不同的特異性和敏感性。Feberwee A等［9］研究指出不應(yīng)該只依賴于某一種檢測方法，因?yàn)檫@些檢測方法存在著不同程度的假陽性結(jié)果。Luciano R L等［19］觀察到SPA、HI和ELSIA三種血清學(xué)檢測方法一致性不顯著，建議陽性結(jié)果應(yīng)該用傳統(tǒng)的微生物學(xué)病原分離和鑒定方法以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行確定。

3.3 分子生物學(xué)方法

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室病原分離培養(yǎng)及血清免疫學(xué)檢測方法耗時(shí)長、費(fèi)用昂貴，在快速診斷方面存在一定弊端，而且，由于血清學(xué)檢測方法是針對(duì)抗體進(jìn)行檢測的技術(shù)，與MG存在明顯的交叉反應(yīng)性，所以，這兩種技術(shù)均不能滿足對(duì)MS進(jìn)行快速確診的要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些用于檢測MS的分子生物學(xué)方法相繼被建立起來。最早是用特異性的重組DNA探針來檢測MS，它們的敏感性是1 ng～2 ng靶DNA分子，相當(dāng)于大約106個(gè)菌落，但這樣大小的菌落數(shù)可能僅出現(xiàn)在急性感染的情況下。為了繼續(xù)提高檢測方法的敏感性和特異性，有學(xué)者根據(jù)MS的16 SrRNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)MS進(jìn)行PCR檢測，與病原培養(yǎng)分離以及血清學(xué)方法相比較，這種方法提高了檢測的敏感性和特異性。但是，由于死亡細(xì)胞的DNA也能夠用PCR方法擴(kuò)增出來，因此，PCR檢測結(jié)果和細(xì)菌細(xì)胞的活性以及感染性沒有直接關(guān)系。鑒于支原體的r RNA沒有DNA穩(wěn)定，基于MS的16 SrRNA的RT－PCR檢測方法被建立起來，可以用來檢測有活性的或者最近死亡的（23 h之內(nèi)）MS細(xì)胞。

MS和MG存在著一定程度上的抗原相似性，用傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法很難把它們區(qū)分開來。而基于16 SrRNA設(shè)計(jì)引物的PCR方法，由于相似性高達(dá)78%，還需要限制性酶切片段分析和特異性探針雜交方法進(jìn)行驗(yàn)證。而且這些方法會(huì)伴隨著其他非相關(guān)細(xì)菌DNA的擴(kuò)增。因此，基于支原體血凝素蛋白基因的PCR檢測方法相繼被建立起來。Hong Y等［20］根據(jù) MS的vlh A基因建立了真對(duì)不同來源的商業(yè)雞場MS田間分離株進(jìn)行檢測和分型PCR方法。MS和MG在臨床上常出現(xiàn)混合感染，對(duì)其進(jìn)行快速鑒別診斷是凈化和盡快采取防控措施的前提。Mardassi B B等［21］針對(duì)編碼 MG 血凝素蛋白基因p MGA1.2和MS的vlh A基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了多重套式PCR檢測方法，可以非常敏感和特異性的同時(shí)檢測這兩種重要的禽類支原體。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，多重PCR簡化了檢測程序，特別是在臨床癥狀不典型、多種疾病混合感染的情況下，大大提高鑒別診斷的速度，節(jié)約生物試劑和人力資源。

此外，傳統(tǒng)的PCR檢測方法需要標(biāo)準(zhǔn)的凝膠電泳分析，增加了由于擴(kuò)增子攜帶污染導(dǎo)致的假陽性風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）比普通PCR更敏感、更快速，而且不需要擴(kuò)增后的凝膠電泳分析。Jarquin R等［22］基于 MG和 MS的16 SrRNA設(shè)計(jì)引物，建立了Real－time SYBR green PCR分析方法，可以在同一反應(yīng)中檢測MG和MS，減少對(duì)霉形體暴發(fā)做出準(zhǔn)確診斷的時(shí)間。Sprygin基于MG的mgc2基因和MS的vlh A基因，用Taq Man標(biāo)記的探針作為內(nèi)參照避免了假陰性結(jié)果，建立了高度敏感性、特異性并且重復(fù)性好的多重Real－time Taq Man PCR分析方法，能夠同時(shí)檢測MG和MS，不僅可以用于商業(yè)雞群和火雞群，而且可以用于鴨和鵝的檢測［23］。

3.4 其他診斷方法

由于一些國家和地區(qū)使用致弱的MS活疫苗免疫雞群，疫苗株和田間分離株的鑒別對(duì)流行病學(xué)跟蹤是非常有意義的?；谶@種目的，MS限制性內(nèi)切酶多型性分析（RFLP）被建立起來。但RFLP需要病原分離培養(yǎng)，提取基因組DNA，比較浪費(fèi)時(shí)間，尤其是一些單一MS分離株的后代，可能會(huì)發(fā)生基因組重排，導(dǎo)致結(jié)果不可信。為此，一些研究者通過對(duì)MS vlh A基因的單拷貝保守區(qū)進(jìn)行測序，進(jìn)行MS分型和流行病學(xué)調(diào)查［20］。此外，Jeffery N 等［24］建立了針對(duì)MS vlh A基因的以PCR基礎(chǔ)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性和熔解曲線分析技術(shù)，為檢測和鑒別MS株提供了高分辨率突變檢測工具。

4 防控措施

良好的飼養(yǎng)管理和健全的生物安全措施是控制禽支原形體病的基礎(chǔ)。此外，還要加強(qiáng)祖代和父母代種雞群MS的流行病學(xué)檢測，致力于無支原體感染種雞群的培育。

藥物治療是防治禽支原體感染的一種常用方法，方便、快捷，能及時(shí)減輕已發(fā)病雞群的癥狀。但不同菌株對(duì)抗生素敏感性存在差異，最好對(duì)本場分離的支原體做藥敏試驗(yàn)，選用高敏藥物進(jìn)行治療。Landman W J等［25］體外研究表明17種 MS荷蘭本地分離株以及典型株WVU 1853均對(duì)強(qiáng)力霉素、泰樂菌素和替米考星敏感。

隨著MS耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，以及禽產(chǎn)品的藥物殘留，藥物治療在生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越受到限制。人們探討用疫苗接種來防制家禽支原體病，但支原體的培養(yǎng)條件比較苛刻，疫苗的制造成本比較高。目前僅在澳大利亞等國家有商品化的MS滅活疫苗和弱毒疫苗應(yīng)用［26］。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新型疫苗會(huì)被開發(fā)出來。

5 展望

綜上所述，隨著越來越多關(guān)于家禽滑液囊支原體病原學(xué)、流行病學(xué)和感染致病機(jī)理等知識(shí)的積累，一些快速、敏感和準(zhǔn)確的檢測和診斷方法將會(huì)被陸續(xù)建立，一些新型疫苗將會(huì)被相繼開發(fā)，同時(shí)也會(huì)篩選到一些更高效的治療藥物。支原體自身的變異特性、免疫逃逸功能決定了禽支原體病比急性、烈性傳染病更加難于控制，防控禽支原體病會(huì)是一項(xiàng)長期動(dòng)態(tài)、細(xì)致復(fù)雜的工作，要嚴(yán)格做好種用禽群的支原體凈化工作，建立無支原體感染種禽群，通過環(huán)境控制、有效疫苗免疫和敏感藥物程序性用藥，控制禽支原體病。

［1］Buim M R，Buzinhani M，Yamaguti M，et al.Mycoplasma synoviae cell invasion：elucidation of the Mycoplasma pathogenesis in chicken［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2011，34（1）：41－47.

［2］Landman W J，F(xiàn)eberwee A.Longitudinal field study on the occurrence of Mycoplasma synoviae in Dutch turkey flocks with lameness and experimental induction of the condition［J］.Avian Pathol，2012，41（2）：141－149.

［3］Gole V C，Chousalkar K K，Roberts J R.Prevalence of antibodies to Mycoplasma synoviae in laying hens and possible effects on egg shell quality［J］.Prev Vet Med，2012，106（1）：75－78.

［4］Feberwee A，de Wit J J，Landman W J.Induction of eggshell apex abnormalities by Mycoplasma synoviae：field and experimental studies［J］.Avian Pathol，2009，38（1）：77－85.

［5］Feberwee A，Landman W J.Induction of eggshell apex abnormalities in broiler breeder hens［J］.Avian Pathol，2010，39（2）：133－137.

［6］Catania S，Bilato D，Gobbo F，et al.Treatment of eggshell abnormalities and reduced egg production caused by Mycoplasma synoviae infection［J］.Avian Dis，2010，54（2）：961－964.

［7］Dufour－Gesbert F，Dheilly A，Marois C，et al.Epidemiological study on Mycoplasma synoviae infection in layers［J］.Vet Microbiol，2006，114（1－2）：148－154.

［8］Xavier J，Pascal D，Crespo E，et al.Seroprevalence of Salmonella and Mycoplasma infection in backyard chickens in the state of Entre Rios in Argentina［J］.Poult Sci，2011，90（4）：746－751.

［9］Feberwee A，de Vries T S，Landman W J.Seroprevalence of Mycoplasma synoviae in Dutch commercial poultry farms［J］.Avian Pathol，2008，37（6）：629－633.

［10］丁美娟，張小飛，尹秀鳳，等.雞滑液囊支原體的分離和鑒定研究 ［J］.中國家禽，2012，33（24）：27－29.

［11］宋戰(zhàn)勝.雞滑液囊支原體病發(fā)病情況調(diào)查及診治 ［J］.中國家禽，2009，31（12）：51－52.

［12］Noormohammadi A H.Role of phenotypic diversity in pathogenesis of avian mycoplasmosis［J］.Avian Pathol，2007，36（6）：439－444.

［13］Khiari A B，Gueriri I，Mohammed R B，et al.Characterization of a variant vlh A gene of Mycoplasma synoviae，strain WVU 1853，with a highly divergent haemagglutinin region［J］.BMC Microbiol，2010，10（6）.

［14］Noormohammadi A，Markham P，Whithear K，et al.Mycoplasma synoviae has two distinct phase－variable major membrane antigens，one of which is a putative hemagglutinin［J］.Infection and immunity，1997，65（7）：2542－2547.

［15］Bencina D.Haemagglutinins of pathogenic avian mycoplasmas［J］.Avian Pathol，2002，31（6）：535－547.

［16］Hagan J C，Ashton N J，Bradbury J M，et al.Evaluation of an egg yolk enzyme－linked immunosorbent assay antibody test and its use to assess the prevalence of Mycoplasma synoviae in UK laying hens［J］.Avian Pathol，2004，33（1）：93－97.

［17］Noormohammadi A H，Markham P F，Markham J F，et al.Mycoplasma synoviae surface protein MSPB as a recombinant antigen in an indirect ELISA ［J］.Microbiology，1999，145（Pt 8）2087－2094.

［18］Oh K，Lee S，Seo J，et al.Rapid serodiagnosis with the use of surface plasmon resonance imaging for the detection of antibodies against major surface protein A of Mycoplasma synoviae in chickens［J］.Can J Vet Res，2010，74（1）：71－74.

［19］Luciano R L，Cardoso A L，Stoppa G F，et al.Comparative study of serological tests for Mycoplasma synoviae diagnosis in commercial poultry breeders［J］.Vet Med Int，2011，2011（304349）.

［20］Hong Y，Garcia M，Leiting V，et al.Specific detection and typing of Mycoplasma synoviae strains in poultry with PCR and DNA sequence analysis targeting the hemagglutinin encoding gene vlh A ［J］.Avian Dis，2004，48（3）：606－616.

［21］Mardassi B B，Mohamed R B，Gueriri I，et al.Duplex PCR to differentiate between Mycoplasmasynoviae and Mycoplasma gallisepticum on the basis of conserved species－specific sequences of their hemagglutinin genes［J］.J Clin Microbiol，2005，43（2）：948－958.

［22］Jarquin R，Schultz J，Hanning I，et al.Development of a real－time polymerase chain reaction assay for the simultaneous detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae under industry conditions［J］.Avian Dis，2009，53（1）：73－77.

［23］Sprygin A V，Andreychuk D B，Kolotilov A N，et al.Development of a duplex real－time Taq Man PCR assay with an internal control for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samples from commercial and backyard poultry［J］.Avian Pathol，2010，39（2）：99－109.

［24］Jeffery N，Gasser R B，Steer P A，et al.Classification of Mycoplasma synoviae strains using single－strand conformation polymorphism and high－resolution melting－curve analysis of the vlh A gene single－copy region［J］.Microbiology，2007，153（Pt 8）：2679－2688.

［25］Landman W J，Mevius D J，Veldman K T，et al.In vitro antibiotic susceptibility of dutch Mycoplasma synoviae field isolates originating from joint lesions and the respiratory tract of commercial poultry［J］.Avian Pathol，2008，37（4）：415－420.

［26］Feberwee A，Morrow C J，Ghorashi S A，et al.Effect of a live Mycoplasma synoviae vaccine on the production of eggshell apex abnormalities induced by a M.synoviae infection preceded by an infection with infectious bronchitis virus D1466［J］.Avian Pathol，2009，38（5）：333－340.