新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白功能及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

鄒海濤，蘭鄒然，姜 平

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟(jì)南 250022）

新城疫（Newcastle disease，ND），又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟，是一種由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以呼吸道和消化道黏膜出血為特征性病變的烈性傳染病。ND具有高度接觸傳染性，傳播速度極快，急性發(fā)病時(shí)病死率接近100%，嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)，故世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一。在我國(guó)，ND的暴發(fā)和流行雖已得到較好的控制，但是NDV不同毒株間毒力有較大差異，且在高免疫壓力下，隨著時(shí)間推移病毒也隨之發(fā)生著一定的變異，給NDV檢測(cè)工作帶來(lái)了困難。傳統(tǒng)的病原分離鑒定以及血清學(xué)檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且具有一定局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，NDV檢測(cè)技術(shù)也得到了長(zhǎng)足發(fā)展，但是這些新技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中都存在一定的缺陷或弱點(diǎn)。因此，深入研究NDV各部分結(jié)構(gòu)及其功能，進(jìn)而改進(jìn)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)或開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)已成為目前ND防控工作的一個(gè)重點(diǎn)。

1 新城疫病毒的結(jié)構(gòu)

新城疫病毒屬副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纖突，其基因組為一長(zhǎng)約15kb的單股負(fù)鏈RNA。NDV不同毒株其基因組大小略有差異，但各毒株的基因組堿基數(shù)均為6的倍數(shù)，這種6堿基機(jī)制對(duì)NDV的復(fù)制有著至關(guān)重要的作用[1]。NDV的基因組不分節(jié)段，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（NP）、磷酸化蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素－神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN）以及具有RNA依賴性的RNA聚合酶蛋白（L）。P、NP和L稱為內(nèi)部蛋白，與病毒RNA組成核糖核蛋白體（RNP）；M、F和HN則稱為外部蛋白。

1.1 NP蛋白

NP蛋白是一種與病毒的增殖密切相關(guān)的病毒多肽，對(duì)病毒核衣殼的形成至關(guān)重要[2]。NP蛋白帶有大量電荷，而由大量堿性氨基酸構(gòu)成的M蛋白帶有強(qiáng)正電荷，二者通過(guò)電荷相互作用，將RNP準(zhǔn)確的包裝入病毒粒子中。雖然NP蛋白不能對(duì)NDV的感染和毒力起決定作用，但NP蛋白與基因組RNA共同組成NP－RNA復(fù)合體，作為復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板，包含免疫顯性抗原決定簇，具有高度的免疫原性[3]，能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫作用。NP蛋白mRNA的3＇非編碼區(qū)在強(qiáng)弱毒株間表現(xiàn)出相當(dāng)大的差異，但能否作為強(qiáng)弱毒判定的標(biāo)準(zhǔn)目前尚無(wú)定論。

1.2 P蛋白

P蛋白可與L蛋白形成復(fù)合物，產(chǎn)生酶活性。P蛋白作為NP蛋白的分子伴侶能夠阻止NP蛋白在合成之后發(fā)生自動(dòng)裝配的特性，防止NP蛋白對(duì)非NDV RNA進(jìn)行衣殼化。P基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象，形成2種衍生蛋白V和 W。V蛋白與NDV的復(fù)制和組織嗜性有關(guān)，對(duì)干擾素有頡頏作用，從而影響NDV的毒力。這種頡頏作用主要與V蛋白位于兩端的4個(gè)氨基酸位點(diǎn)有關(guān)[4]。此外，W蛋白對(duì)NDV的生物活性也有重要的作用[5]。

1.3 M 蛋白

M蛋白是存在于病毒囊膜內(nèi)層的一種非糖基化蛋白，在病毒裝配的過(guò)程中對(duì)病毒囊膜的形成、核衣殼與囊膜之間的識(shí)別、維持病毒粒子結(jié)構(gòu)完整性有著重要的作用。一系列分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示M蛋白在不同的NDV分離株中具有極高的保守性。M蛋白還可抑制宿主RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，與病毒的致病力有關(guān)。Yin R F等[6]借助RNA干擾技術(shù)對(duì)M基因的第641和第827堿基位點(diǎn)進(jìn)行特異性沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制能力明顯降低。若NDV毒株M基因發(fā)生突變，則該毒株在宿主體內(nèi)不能出芽，僅表現(xiàn)為持續(xù)性感染。

1.4 F蛋白

F蛋白以纖突形式呈現(xiàn)在囊膜以外，是NDV最重要的毒力蛋白和保護(hù)性抗原。不同毒株的F基因序列存在差異，差異越大，毒株間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。F蛋白參與NDV與靶細(xì)胞作用的過(guò)程，使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，從而使病毒能穿過(guò)宿主細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿，脫去核衣殼進(jìn)行復(fù)制。在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)蛋白跨膜區(qū)特異性序列起著相當(dāng)重要的作用，它能夠影響胞外區(qū)活化前的構(gòu)象以及F蛋白與HN蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)融合活性[7]。

F蛋白最初是以一種無(wú)活性的前體蛋白F0的形式被合成，F(xiàn)0的C端嵌入病毒囊膜之中，而后被細(xì)胞內(nèi)的胰蛋白酶在第112～117位氨基酸殘基處裂解為F1和F2。F1多肽N端插入宿主細(xì)胞的脂質(zhì)層繼而發(fā)揮活性作用，啟動(dòng)膜融合，NDV才產(chǎn)生感染性。以往普遍認(rèn)為該裂解位點(diǎn)的氨基酸序列及裂解能力是NDV毒力的惟一決定性因素。不過(guò)近年來(lái)的研究表明F蛋白的裂解能力并不是NDV毒力的惟一決定性因素[8]。國(guó)外學(xué)者通過(guò)反向遺傳技術(shù)將NDV高致病性毒株與非致病性毒株的NP、P、M、L編碼區(qū)進(jìn)行相應(yīng)置換，而后將拯救出的病毒接種動(dòng)物，同時(shí)將重組的病毒基因組轉(zhuǎn)染單層細(xì)胞，以評(píng)估重組病毒的致病力與復(fù)制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原強(qiáng)毒株重組后，病毒的復(fù)制能力降低，致病力有明顯的減弱，相比之下無(wú)致病力毒株則呈現(xiàn)了相反情況，特別是在置換了NP、P和L等3個(gè)編碼區(qū)后，病毒復(fù)制能力明顯增強(qiáng)，致病力變?yōu)樵鹊?0倍[9]。說(shuō)明真正決定NDV毒力的因素是病毒的復(fù)制能力，并非僅僅是F蛋白的裂解能力。

1.5 HN蛋白

HN蛋白是一種既有血凝素（HA）活性又有神經(jīng)氨酸酶（NA）活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保護(hù)性抗原。HA活性能夠使病毒吸附到對(duì)應(yīng)靶細(xì)胞的受體上，NA活性則破壞細(xì)胞受體，從感染細(xì)胞表面釋放病毒粒子。同時(shí)HN蛋白還能夠促進(jìn)膜融合，吸引F蛋白充分接近該位點(diǎn)，繼而啟動(dòng)病毒與細(xì)胞膜融合。HN蛋白mRNA的5＇非編碼區(qū)（UTR）是NDV毒力的影響因子之一，若將其缺失，NDV復(fù)制不會(huì)受到影響，但卻可以降低病毒的致病力[10]。此外，若 HN 蛋白第526位氨基酸發(fā)生突變，HN蛋白的活性將會(huì)減弱，NDV的復(fù)制將會(huì)受其影響，致病力降低[11]。HN蛋白N末端胞內(nèi)區(qū)的5個(gè)氨基酸位點(diǎn)（第1、2、3、4、6位）對(duì)病毒與細(xì)胞的融合、病毒毒力以及HN蛋白和M蛋白的定位有著極其重要的作用[12]。這一系列研究表明，病毒的組織嗜性依賴于HN蛋白，故HN蛋白是NDV致病力的必需因子，與F基因共同決定著NDV的毒力強(qiáng)弱，進(jìn)一步印證了F蛋白裂解能力不是NDV毒力唯一決定因素的結(jié)論。

1.6 L蛋白

L蛋白是RNA依賴性的RNA聚合酶的主要組成部分，且參與RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的大部分酶的活性都來(lái)源于L蛋白。秦紅剛等[13]通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)位于NDV L基因上的P1595、P2103、P3277等3個(gè)酶活性中心區(qū)域進(jìn)行沉默。結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性的沉默這3個(gè)區(qū)域的表達(dá)會(huì)抑制病毒的復(fù)制，影響子代病毒粒子的組裝和釋放，說(shuō)明了P1595、P2103和P3277這3個(gè)區(qū)域?qū)τ贚蛋白發(fā)揮RNA依賴的RNA聚合酶的功能具有重要的作用。此外，國(guó)外學(xué)者借助反向遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)L基因可影響病毒復(fù)制能力，進(jìn)而影響NDV的致病力[14]。

2 新城疫病毒的檢測(cè)技術(shù)

2.1 RT－PCR技術(shù)

RT－PCR檢測(cè)技術(shù)具有快捷、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，消除了常規(guī)血清學(xué)診斷方法中非特異性因素的干擾及敏感性問(wèn)題，得到了OIE的認(rèn)可。雖然國(guó)內(nèi)外已建立了許多成熟的RT－PCR方法，但是RTPCR檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)了各種各樣缺陷，因此仍然需要不斷地對(duì)該技術(shù)進(jìn)行改良和優(yōu)化。

Liu H L等[15]根據(jù)多個(gè)NDV野毒分離株的F基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物并優(yōu)化了反應(yīng)條件，建立了二重RT－PCR檢測(cè)方法，將NDV檢測(cè)以及Ⅰ和Ⅱ型NDV的鑒別一次性完成。試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用此方法，Ⅰ型NDV參考毒株可擴(kuò)增出433 bp的特異性條帶，Ⅱ型參考毒株可擴(kuò)增出535bp的特異性條帶，同批檢測(cè)的AIV、IBV、IBDV均無(wú)特異性擴(kuò)增條帶。隨后他們又對(duì)67份野毒樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與病毒基因測(cè)序結(jié)果相一致。同樣是根據(jù)NDV F基因的序列，Zhang L等[16]設(shè)計(jì)了一條通用上游引物F1和2條特異性下游引物F2、F3，進(jìn)而建立了半套式RT－PCR檢測(cè)方法。先利用引物對(duì)F1＋F2確定NDV的存在，進(jìn)而再用引物對(duì)F2＋F3鑒定NDV毒株的毒力。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該方法的敏感度要比普通RT－PCR方法敏感1000倍。鑒于NDV感染在臨床上極易與AIV感染混淆，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所的研究人員根據(jù)H5－AIV和H9－AIV的H基因以及NDV的F基因設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了三重RT－PCR檢測(cè)體系[17]。隨后將該體系與傳統(tǒng)單一RT－PCR檢測(cè)體系進(jìn)行對(duì)比，二者的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.2 熒光定量RT－PCR技術(shù)

Real－time RT－PCR技術(shù)是通過(guò)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，提高了靈敏度，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的DNA定量，具有廣闊的發(fā)展前景。目前，該技術(shù)已被應(yīng)用于包括NDV、PRRSV、CSFV等多種動(dòng)物疫病檢測(cè)。

Wise M G等[18]根據(jù)NDV M基因的保守序列設(shè)計(jì)了引物和水解探針，其檢測(cè)敏感度可達(dá)到10 EID50。Fuller C M等[19]建立了基于L基因的Realtime RT－PCR方法，如若將其與 Wise M G等建立的方法結(jié)合，則基本上可涵蓋所有Ⅰ型和Ⅱ型NDV毒株。在實(shí)際工作中，需要判定NDV分離株是否為強(qiáng)毒株。為此，國(guó)外在普通Real－time RT－PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出了若干種多重Real－time RT－PCR體系，用以鑒定NDV分離株。Tan S W 等[20]通過(guò)分析NDV不同毒力毒株NP基因的序列，設(shè)計(jì)了2條通用引物以及2條特異性探針，采用SYBR Green I染料建立了兩步法Real－time RT－PCR檢測(cè)方法。經(jīng)驗(yàn)證，該方法敏感度可達(dá)到3×105個(gè)病毒拷貝，較普通RT－PCR方法提高了10倍。同樣是使用SYBR Green I染料，Nidzworski D 等[21]則是根 據(jù)NDV F基因裂解位點(diǎn)附近的序列設(shè)計(jì)了一套R(shí)ealtime RT－PCR檢測(cè)方法，對(duì)強(qiáng)毒株和弱毒株的敏感度可分別達(dá)到102EID50和103EID50。此外，多重?zé)晒舛縋CR體系還可用于鑒別AIV和NDV。謝芝勛等[22]根據(jù)AIV和NDV的基因保守序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物和2條用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)AIV和NDV的二重?zé)晒舛縍T－PCR方法，對(duì)AIV和NDV的檢測(cè)敏感性均可達(dá)到2000個(gè)拷貝，比常規(guī)RT－PCR敏感性高100倍。

綜合來(lái)看，熒光定量PCR技術(shù)不僅可以對(duì)樣品中的病毒含量進(jìn)行定量，而且靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染。但是若待檢樣品數(shù)量較大時(shí)，單重?zé)晒舛縋CR的成本耗費(fèi)較高，經(jīng)濟(jì)性偏低。因此高通量、低成本、高效率的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù)更值得進(jìn)一步發(fā)展和推廣。

2.3 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增（RT－LAMP）是近年來(lái)新興的一種快速DNA擴(kuò)增技術(shù)，其基本原理在于利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。RT－LAMP技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、反應(yīng)迅速、設(shè)備要求低等特點(diǎn)。目前，該技術(shù)在人類病毒性疾病的診斷領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但是在動(dòng)物病毒性疾病診斷領(lǐng)域尚處在嘗試階段。

Pham H M等[23]設(shè)計(jì)了一套以NDV F基因?yàn)榘谢虻腞T－LAMP特異性引物，僅需將反應(yīng)體系水浴加熱2h，即可完成檢測(cè)，檢測(cè)敏感度可達(dá)到0.5pg DNA，其特異性與敏感性均達(dá)到了套式RTPCR水平。陳安莉等[24]根據(jù)NDV F基因的8個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)了可鑒別強(qiáng)弱毒株的3套特異性引物，建立了可區(qū)分NDV的強(qiáng)弱毒株的RT－LAMP檢測(cè)法，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.01pg病毒RNA，是普通RT－PCR檢測(cè)的100倍。

此外，通過(guò)添加Loop引物，反應(yīng)速度可進(jìn)一步提高，縮短約一半的反應(yīng)時(shí)間；而改變反應(yīng)體系中各組分濃度則可控制假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)幾率，進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.4 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是是近年來(lái)分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)的重要進(jìn)展，根據(jù)點(diǎn)在芯片上的探針的不同分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片及組織芯片等，具有高通量、高靈敏度、自動(dòng)化、微型化等特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，成本較低。

Wang L C等[25]首先根據(jù)NDV F基因和AIV M基因的保守序列設(shè)計(jì)出通用引物，根據(jù)NDV F蛋白裂解位點(diǎn)和AIV HA蛋白裂解為點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)出特異性探針，后進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備靶基因并純化，以點(diǎn)樣儀將制備的靶基因點(diǎn)制在基片上成功制備了基因芯片。該芯片可同時(shí)檢測(cè)NDV、H5和H7亞型AIV，并可對(duì)NDV進(jìn)行強(qiáng)弱毒株鑒別，檢測(cè)結(jié)果肉眼即可觀察，無(wú)須借助其他設(shè)備。隨后的驗(yàn)證試驗(yàn)證明該芯片具有良好的敏感性和特異性。石霖等[26]則將AIV和NDV的蛋白抗原先進(jìn)行純化，用點(diǎn)樣緩沖液稀釋后點(diǎn)于醛基修飾的片基上，制備了國(guó)內(nèi)第一種可視化蛋白芯片。芯片與待檢血清雜交后，再與二抗雜交，銀染顯色后根據(jù)灰度值判定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化，使用極其方便。采用該方法對(duì)18份血清樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，結(jié)果顯示該芯片可特異性的與相應(yīng)的抗體雜交，無(wú)交叉反應(yīng)，而且呈現(xiàn)較強(qiáng)可視化信號(hào)。與瓊擴(kuò)（AGP）抗體檢測(cè)進(jìn)行的符合率比較顯示該可視化蛋白芯片具有很好的特異性，檢測(cè)靈敏度至少為AGP法的400倍。

2.5 膠體金試紙

膠體金試紙是將單克隆抗體技術(shù)、金標(biāo)（將單克隆抗體、多克隆抗體與金離子結(jié)合在一起）技術(shù)、紙上層析技術(shù)組合起來(lái)的一種新的技術(shù)，它以膠體金為顯色劑，利用抗體和抗原反應(yīng)原理來(lái)捕捉病毒并顯色的。膠體金試紙具有快捷、敏感、準(zhǔn)確、廉價(jià)、穩(wěn)定等一系列優(yōu)點(diǎn)。目前頂尖的科研機(jī)構(gòu)和公司的產(chǎn)品對(duì)NDV的測(cè)定靈敏度達(dá)3×103EID50，而且部分商品化試紙條能夠同時(shí)檢測(cè)AIV和NDV。李蓓蓓等[27]研制的NDV－AIV復(fù)合型膠體金免疫層析檢測(cè)可在10min中完成對(duì)2種疾病的檢測(cè)，NDV的檢測(cè)靈敏度為傳統(tǒng)血凝血抑試驗(yàn)的8倍，重復(fù)性、穩(wěn)定性以及特異性均達(dá)到了理想水平。因此，膠體金試紙是一種非常適合于基層NDV防控檢測(cè)的技術(shù)手段。

2.6 聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)

除了前文中所述技術(shù)，部分單位和機(jī)構(gòu)還將多種檢測(cè)技術(shù)或平臺(tái)相結(jié)合，建立了一些聯(lián)合檢測(cè)平臺(tái)，例如PCR－DHPLC（PCR－變性液相高效色譜）聯(lián)合檢測(cè)[28]、免疫 PCR[29]、流式微球免疫檢測(cè)[30]等。這些聯(lián)合檢測(cè)法最大的優(yōu)勢(shì)在于極高的檢測(cè)敏感度，其中的一些方法其敏感度可達(dá)到10－1.5ELD50／0.1mL。雖然這些方法在檢測(cè)的敏感度和準(zhǔn)確性上達(dá)到了較高的水平，但是這些方法都需要昂貴的儀器設(shè)備和試劑，檢測(cè)成本較高，并且對(duì)操作人員的水平要求較高，因此并不適用于基層檢測(cè)，而更適用于出入境檢驗(yàn)檢疫檢測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)NDV的結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)的功能的研究取得了一定的研究成果，但這仍然是需要研究者們不斷探索的領(lǐng)域，特別是NDV的基因組學(xué)及蛋白組學(xué)。只有更進(jìn)一步的搞清NDV的分子生物學(xué)特性，才能研究出更好的檢測(cè)技術(shù)及防控措施。NDV的防控工作仍然任重道遠(yuǎn)。從目前國(guó)內(nèi)的實(shí)際情況來(lái)看，NDV的檢測(cè)應(yīng)該形成更加完善的體系，可以根據(jù)不同的檢測(cè)目的和要求，采取不同的檢測(cè)技術(shù)措施。對(duì)于基層，可以采取低成本、設(shè)備要求低、便于操作、高準(zhǔn)確性的檢測(cè)方法，如膠體金試紙、多重RT－PCR、RT－LAMP等；而對(duì)于大面積疫病監(jiān)測(cè)以及出入境檢疫，則可以選擇高通量、高效率、高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測(cè)平臺(tái)，如熒光定量RTPCR、生物芯片、PCR－DHPLC等。

值得注意的是隨著對(duì)NDV結(jié)構(gòu)蛋白功能研究的深入，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)附近的氨基酸序列不再是毒力強(qiáng)弱的惟一判定標(biāo)準(zhǔn)。因此，具有更高適用性的NDV強(qiáng)弱毒株鑒別檢測(cè)技術(shù)的研究工作也許將會(huì)是下一步NDV防控工作的核心內(nèi)容。

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