神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合自體變性肌橋修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究

李 政 周 明

神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合自體變性肌橋修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究

李 政 周 明

目的探討PLGA神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合化學(xué)萃取的自體骨骼肌肌橋，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的可能性。方法SD大鼠45只，建立大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)缺損模型。隨機(jī)分為3組，分別采用自體神經(jīng)（A組）、PLGA神經(jīng)導(dǎo)管（B組）和PLGA神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合化學(xué)萃取自體骨骼肌肌橋（C組），來修復(fù)神經(jīng)缺損。術(shù)后通過大體觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測(cè)定、腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率測(cè)定、組織學(xué)觀察和圖像分析對(duì)比等，檢測(cè)神經(jīng)缺損修復(fù)情況。結(jié)果神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合化學(xué)萃取自體骨骼肌肌橋能促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于單純神經(jīng)導(dǎo)管移植，但是效果略差于自體神經(jīng)移植。結(jié)論P(yáng)LGA神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合化學(xué)萃取自體骨骼肌肌橋，對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損具有良好的橋梁作用和促神經(jīng)生長的作用。

神經(jīng)再生神經(jīng)導(dǎo)管聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物變性骨骼肌肌橋

周圍神經(jīng)長段缺損是臨床較棘手的問題，目前的最佳修復(fù)方法依舊是自體神經(jīng)移植，但存在諸多缺點(diǎn)。多年來人們一直在嘗試應(yīng)用人工神經(jīng)來修復(fù)周圍神經(jīng)的長段缺損，但尚無理想結(jié)果。

理想的人工神經(jīng)應(yīng)是一種特定的三維結(jié)構(gòu)支架的神經(jīng)導(dǎo)管，可接納再生軸突的長入，對(duì)軸突起機(jī)械引導(dǎo)作用；導(dǎo)管材料應(yīng)具有良好的組織相容性、適當(dāng)?shù)目讖胶涂紫堵省⒖山到庑约敖到馑俾士烧{(diào)控性，并具備一定的機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性。

本實(shí)驗(yàn)研究采用可降解的神經(jīng)導(dǎo)管，聯(lián)合化學(xué)萃取自體肌肉，制作肌肉基底膜管以促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)的再生，為修復(fù)周圍神經(jīng)缺損提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Triton X-100（P ackard，USA）；D eoxycholate鈉鹽（Sigma，USA）；聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物PLGA（四川國家生物材料工程公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠45只（江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為3組，每組15只。A組為自體神經(jīng)移植組；B組為PLGA神經(jīng)導(dǎo)管組；C組為PLGA神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合自體肌橋化學(xué)萃取組。

1.3 肌橋的化學(xué)萃取

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在腹腔麻醉下，從左側(cè)股二頭肌處切取3 cm×2 cm×1 cm大小的肌條。采用Sondell法[1]進(jìn)行化學(xué)萃取，制備無細(xì)胞基底膜管移植物，將股二頭肌肌條置于蒸餾水內(nèi)，在室溫下保持7 h并換液數(shù)次，然后置于3%的Triton X-100蒸餾水溶液中室溫過夜（12 h），接著置于4%的Deoxycholate鈉鹽蒸餾水溶液中連續(xù)震蕩24 h，進(jìn)行萃取處理。上述程序重復(fù)一遍，最后將萃取后的移植物水洗后置于4℃、pH 7.2的磷酸緩沖液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PLGA神經(jīng)導(dǎo)管的制作[2]

聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物PLGA（85∶15）制成管長12 mm、壁厚0.3 mm、內(nèi)徑1.5 mm的神經(jīng)導(dǎo)管；導(dǎo)管置于P2O5的干燥器中，-20℃保存，導(dǎo)管植入體內(nèi)前甲醛熏蒸4 h。

1.5 手術(shù)方法

10%水合氯醛腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位，由原手術(shù)切口分離顯露大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)，A組于坐骨神經(jīng)中段切取神經(jīng)干l0mm，近遠(yuǎn)端顛倒后9-0線兩端各縫合2針。其他兩組均銳性切除坐骨神經(jīng)干6 mm，讓斷端缺損自然回縮至10 mm；B組用9-0線將PLGA導(dǎo)管兩端縫合固定；C組將自體化學(xué)萃取肌肉修剪為長9 mm、直徑1.5 mm左右的橋段置入神經(jīng)導(dǎo)管，神經(jīng)斷端兩端各插入1mm，9-0線導(dǎo)管兩端縫合固定。術(shù)畢慶大霉素沖洗并關(guān)閉切口。術(shù)側(cè)大鼠下肢管形石膏固定，2周后去除石膏。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 大體觀察

術(shù)后定期觀察各組術(shù)側(cè)足底、足趾的皮膚潰瘍情況，以及后肢肌肉萎縮程度和關(guān)節(jié)屈伸情況。

1.6.2 坐骨神經(jīng)指數(shù)

術(shù)后第2、4、6、8周，各組SD鼠雙后足涂上碳素墨水，置于自制的大鼠足印行走箱中，得到相應(yīng)足印，測(cè)量各指標(biāo)，代入公式計(jì)算坐骨神經(jīng)指數(shù)。參考文獻(xiàn)[3]的方法，選擇印跡清晰的足印分別測(cè)量正常足(N)和傷側(cè)足(E)的3個(gè)指標(biāo)：足印長度（PL）即足尖到足跟的最大距離；足趾寬度（TS）即第1～5趾的距離；中間足趾寬度（IT）即第2～4趾的距離。坐骨神經(jīng)指數(shù)=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS] +13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。坐骨神經(jīng)指數(shù)0%～-11%表示神經(jīng)功能完全正常，-100%表示神經(jīng)功能完全喪失，-11%～-100%表示部分神經(jīng)功能恢復(fù)。

1.6.3 腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率

仔細(xì)分離雙側(cè)腓腸肌，測(cè)量其濕質(zhì)量，計(jì)算腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率。腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率(%)=手術(shù)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量/正常側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量×100%。

1.6.4 組織學(xué)觀察

術(shù)后4周、8周和12周切取移植物，甲醛固定，石蠟包埋，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡觀察。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析移植體中部的橫切面，計(jì)算出神經(jīng)纖維有效面積、髓鞘厚度和神經(jīng)纖維密度。

1.6.5 電鏡標(biāo)本制作及觀察

自移植物中段取材，4%戊二醛、1%鋨酸固定，乙醇逐級(jí)脫水，Epon812包埋、切片，鉛－鈾染色，透射電鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均表現(xiàn)為左側(cè)后肢拖地行走，術(shù)后1周足部皮膚出現(xiàn)紅腫和足跟潰瘍，術(shù)后2周小腿三頭肌出現(xiàn)明顯萎縮，之后小腿三頭肌萎縮逐漸恢復(fù)，足跟部皮膚紅腫或潰瘍逐漸消退。至術(shù)后取材時(shí)各組大鼠均存活，切口愈合良好。

2.2 坐骨神經(jīng)指數(shù)

術(shù)后2、4周，各組坐骨神經(jīng)指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后8周，A組坐骨神經(jīng)指數(shù)與B、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；移植后12周，A組坐骨神經(jīng)指數(shù)略高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組指數(shù)高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 術(shù)后2、4、8、12周各組坐骨神經(jīng)指數(shù)Table1 Sciatic nerve function index of each group 2,4,8 and 12 weeks after operation

2.3 小腿三頭肌濕質(zhì)量恢復(fù)率

術(shù)后12周，A、B、C組小腿三頭肌濕質(zhì)量恢復(fù)率分別為（75.2±4.7）%、（43.3±4.1）%和（61.9±4.4）%。C組與A、B組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），C組與B組比較差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 移植神經(jīng)吻合口遠(yuǎn)段甲苯胺藍(lán)染色觀察

12周取材后的甲苯胺藍(lán)染色顯示，C組再生的神經(jīng)纖維較多，且排列整齊（圖1）,神經(jīng)數(shù)量和軸突直徑以及髓鞘厚度均優(yōu)于B組（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A組各項(xiàng)指標(biāo)均強(qiáng)于C組，其中神經(jīng)纖維有效面積（P＜0.01）和神經(jīng)纖維密度（P＜0.05）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組髓鞘厚度稍強(qiáng)于C組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 C組12周再生神經(jīng)中段橫切面觀（甲苯胺藍(lán)染色，400×）Fig.1 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

圖2 B組12周再生神經(jīng)中段橫切面觀（甲苯胺藍(lán)染色，400×）Fig.2 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(toluidine blue staining,400×)

表2 術(shù)后12周各組再生神經(jīng)圖像分析結(jié)果Table2 Regenerated nerve image analysis of each group 12 weeks after operation

2.5 透射電鏡觀察

術(shù)后12周透射電鏡觀察，C組（圖3）相對(duì)于B組（圖4）再生的有髓神經(jīng)纖維多，髓鞘較厚并且完整，板層排列緊密，軸突膜與髓鞘膜緊密相鄰；但是稍差于A組。

圖3 C組12周再生神經(jīng)中段橫切面觀（透射電鏡，5 000×）Fig.3 Transverse view of regenerated nerve of group C 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

圖4 C組12周再生神經(jīng)中段橫切面觀（透射電鏡，5 000×）Fig.4 Transverse view of regenerated nerve of group B 12 weeks after operation(TEM,5 000×)

3 討論

眾所周知，長段的周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的最佳方法目前仍是自體神經(jīng)移植，但是自體神經(jīng)的來源有限，且可導(dǎo)致供區(qū)神經(jīng)功能喪失或痛性神經(jīng)瘤可能。為了獲得更佳的神經(jīng)修復(fù)效果，人工神經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

以往的研究表明，單純神經(jīng)導(dǎo)管移植能促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生，療效接近自體神經(jīng)移植。其原理就是神經(jīng)斷端間用套管橋接，形成相對(duì)密閉的再生室，充分發(fā)揮神經(jīng)再生的趨化特性、自我調(diào)節(jié)能力及自我修復(fù)能力。

有文獻(xiàn)報(bào)道，通過對(duì)骨骼肌進(jìn)行化學(xué)萃取或冷熱變性后形成變性肌橋，來修復(fù)周圍神經(jīng)的缺損[4-6]，取得了一定的效果。但是由于單純肌橋周圍沒有神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)外周環(huán)境進(jìn)行隔絕，導(dǎo)致肌橋容易被炎性組織浸潤而導(dǎo)致疤痕化，或者被外周組織壓迫而影響再生的神經(jīng)纖維，從而影響了促進(jìn)神經(jīng)再生的效果。

本實(shí)驗(yàn)采用PLGA神經(jīng)導(dǎo)管，聯(lián)合變性的肌橋來對(duì)周圍神經(jīng)缺損進(jìn)行修復(fù)。優(yōu)點(diǎn)如下：①神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)肌橋和神經(jīng)斷端周圍環(huán)境進(jìn)行相對(duì)的隔絕，避免了周圍組織的壓迫和炎性組織的浸潤；②形成神經(jīng)再生室，可充分發(fā)揮神經(jīng)再生的自我調(diào)節(jié)、自我修復(fù)能力；③理想的人工神經(jīng)應(yīng)該能模擬自體神經(jīng)的結(jié)構(gòu)，具備三維立體支架結(jié)構(gòu)，為再生的神經(jīng)軸突和許旺細(xì)胞提供“腳手架”，使許旺細(xì)胞和軸突沿支架有序縱向排列，引導(dǎo)神經(jīng)再生。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)萃取的方法制作肌肉基底膜管，來模擬形成一種中空網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)[7-8]，肌肉基底膜含有層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，能促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，有助于許旺細(xì)胞黏附及軸突沿支架延伸生長。自體肌肉基底膜管不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)[9]；④PLGA神經(jīng)導(dǎo)管已得到美國FDA臨床應(yīng)用許可，具有良好的組織相容性。

本實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組均能有效引導(dǎo)大鼠坐骨神經(jīng)再生并通過大鼠坐骨神經(jīng)缺損間隙，神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合化學(xué)萃取自體肌橋組神經(jīng)修復(fù)效果優(yōu)于單純的神經(jīng)導(dǎo)管組，說明通過對(duì)自體肌肉化學(xué)萃取而形成的肌肉基底膜管能促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生。但是神經(jīng)導(dǎo)管聯(lián)合肌肉基底膜管組的神經(jīng)修復(fù)效果仍然差于自體神經(jīng)移植組。

為了進(jìn)一步獲得更好的神經(jīng)修復(fù)效果，我們將在后續(xù)研究中添加神經(jīng)營養(yǎng)因子、種子細(xì)胞等，并進(jìn)一步研究和比較各種肌肉變性方法所制作的肌肉基底膜管的性能、結(jié)構(gòu)和神經(jīng)修復(fù)效果差異。

[1]Meek MF,Varejao AS,Geuna S.Use of skeletalmuscle tissue in peripheral nerve repair:review of the literature[J].Tissue Eng, 2004,10(7-8):1027-1036.

[2]李政,王偉.NGF/PLGA復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(3):234-237.

[3]沈?qū)幗?朱家愷.坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在神經(jīng)功能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中華顯微外科雜志,1993,16(4):284-287.

[4]Dornseifer U,Fichter AM,Leichtle S,et al.Peripheral nerve reconstructionwith collagen tubes filledwith denatured autologous muscle tissue in the ratmodel[J].Microsurgery,2011,31(8):632-641.

[5]Pereira JH,Palande DD,Narayanakumar TS,etal.Nerve repair by denatured muscle autografts promotes sustained sensory recovery in leprosy[J].JBone Joint Surg Br,2008,90(2):220-224.

[6]Palhares A,Viterbo F,Cardoso RG.Muscle graft as a substitute for peripheralnervegraft in rats[J].Acta Cir Bras,2009,24(3):221-225.

[7]VincenziB,SantiniD,Russo A,etal.Circulating VEGF reduction, responseand outcome in advanced colorectal cancer patients treated with cetuximab plus irinotecan[J].Pharmacogenomics,2007,8(4): 319-327.

[8]Tos P,Battiston B,Nicolino S,et al.Comparison of fresh and predegenerated muscle-vein-combined guides for the repair of ratmedian nerve[J].Microsurgery,2007,27(1):48-55.

[9]KeilhoffG,Goihl A,Stang F,etal.Peripheralnerve tissueengineering: autologous Schwann cells vs.transdifferentiated mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng,2006,12(6):1451-1465.

Denatured A utologous Muscle Graft Combining PLGA Nerve Guide Conduits in Repairing Peripheral Nerve Defects

LIZhen,ZHOU Ming.
Emergency Medical Center,Zhenjiang First People's Hospital,Zhenjiang 212002,China. Corresponding author:ZHOU Ming(E-mail：zhouming212002@163.com).

Objective To explore the feasibility of denatured autologous muscle graft combining PLGA Nerve guide conduits in repairing sciatic nerve defects in rats.M ethods Forty-five Sprague-Dawley rats were random ly divided into three groups(n=15)and the left sciatic nerve defectsmodelwas established on each rat.Autologous nerve(group A),PLGA nerve guide conduits(group B)and denatured autologousmuscle graft combining PLGA nerve guide conduits(group C)were used to bridge the nerve defects.Microscopic observation,sciatic nerve function index，recovery rate of gastrocnemius wet weight,histological observation and computerized imaging analysis were carried out postoperatively.Results The findings showed that denatured autologousmuscle graft combining nerve guide conduitswas better than nerve guide conduits,but less effective than autologous nerve transplantation.Conclusion Denatured autologous muscle graft combining nerve guide conduits can promote the peripheral nerve regeneration and repair nerve defects.

Nerve regeneration;Nerveguide conduits;Poly(lactide-co-glycolide);Denatured autologousmusclegraft

R622+.3

A

1673－0364（2012）03－0146－04

2012年3月2日；

2012年3月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.006

212002江蘇省鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心。

周明（E-mail：zhouming212002@163.com）。