不同來源成體干細(xì)胞及不同細(xì)胞系的微囊化包裹

張書紅 沈 陽 湯亭亭

不同來源成體干細(xì)胞及不同細(xì)胞系的微囊化包裹

張書紅 沈 陽 湯亭亭

目的研究不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及不同的細(xì)胞系在微囊內(nèi)的存活情況，為促進(jìn)骨再生微囊化基因給藥平臺的建立提供實(shí)驗基礎(chǔ)。方法從大鼠骨髓、脂肪和滑膜中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs），并培養(yǎng)C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細(xì)胞系，利用高壓靜電法制作包裹以上細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸（APA）微囊，然后用EB/Calcein-AM染色方法測定細(xì)胞在微囊內(nèi)1周及4周的存活情況。結(jié)果不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細(xì)胞系在APA微囊內(nèi)1周及4周的存活率均較高。結(jié)論不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細(xì)胞系可在APA微囊內(nèi)長期存活。

微囊間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞系

在細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域，目前研究和應(yīng)用較多的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。MSCs廣泛分布于人體各種器官和組織，如骨髓、脂肪和滑膜中，具有取材方便、容易獲得等優(yōu)勢。MSCs具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。

MSCs雖然廣泛分布于人體各種器官和組織中，但研究最多的是骨髓來源的MSCs，其他如脂肪、滑膜來源的MSCs近年來也有廣泛報告。MSCs的分離、培養(yǎng)至今缺乏統(tǒng)一的方法。由于沒有可靠的特異性表面標(biāo)志分子，不易應(yīng)用流式細(xì)胞儀或免疫磁珠對其進(jìn)行分選。目前MSCs的分離和培養(yǎng)通常采用貼壁培養(yǎng)法，但所得干細(xì)胞的特性和狀態(tài)不盡相同。

在前期研究中，我們已建立了骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊化包裹方法。本研究中，我們擬對骨髓、脂肪、滑膜等不同的來源MSCs，以及3種不同來源的細(xì)胞系：成纖維細(xì)胞系（C3H10T1/2）、成肌細(xì)胞系（C2C12）和前成骨細(xì)胞系（NIH/3T3）進(jìn)行微囊包裹，并比較6種細(xì)胞在微囊內(nèi)存活能力的差異，為進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)染研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

海藻酸鈉（Sigma，美國）；聚賴氨酸（FLUKA，美國）；培養(yǎng)基α-MEM（GIBCO，美國）；Calcein-AM（Calbiochem，美國）。

高壓靜電場成囊裝置（上海理工大學(xué)研制，中國）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）；CO2培養(yǎng)箱（THERMO，美國）；液氮罐（CBS，美國）；臺式離心機(jī)（Eppendorf，德國）；電子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 不同來源MSCs的分離與培養(yǎng)

分別取SD大鼠（中國科學(xué)院上海實(shí)驗動物中心提供）的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、脂肪干細(xì)胞（ADSCs）和滑膜干細(xì)胞（SMSCs），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的10 m LαMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。次日換液以除去死細(xì)胞，以后每隔2天換液。待細(xì)胞增殖達(dá)到80%～90%融合時，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，1∶4傳代培養(yǎng)。

1.2.2 三種細(xì)胞系的來源和培養(yǎng)

成纖維細(xì)胞系（C3H10T1/2）、成肌細(xì)胞系（C2C12）和前成骨細(xì)胞系（NIH/3T3）均來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。C3H10T1/2與NIH/ 3T3用αMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，而C2C12用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞微囊的制備

參照文獻(xiàn)[1]的方法制備包裹干細(xì)胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步驟如下：①將上述所得細(xì)胞懸液與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞終濃度為3×106cells/mL，海藻酸鈉終濃度為1.75%；②置于電壓為3 KV、液面距25mm、推進(jìn)速度30 mm/h的高壓靜電場成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/LCaCl2溶液中并反應(yīng)10min，0.9%NaCl洗滌2次；③再與0.05%聚賴氨酸溶液反應(yīng)使微粒外包裹一層聚賴氨酸并反應(yīng)5 min后 0.9%NaCl洗滌2次；④加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9%NaCl洗滌2次；⑤最后用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌2次；⑥所得微囊置于無菌培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)液10mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.4 EB/Calcein-AM染色

將細(xì)胞微囊用PBS洗滌后，于96孔板中每孔加入100mg/L的EB溶液3μL（終濃度約8μmol/L）及50μmol/L的Calcein-AM溶液10μL（終濃度為5μmol/L）。孵育20min后，在熒光顯微鏡下觀察。Calcein-AM溶液配置步驟如下：①用DMSO配置1mmol/L的Calcein-AM（即在其中加入1mLDMSO-dimethylsulfoxide溶解）；②用PBS稀釋至1～50μmol/L，加入1/10培養(yǎng)基的量（100μL加入10μL）。細(xì)胞染色后用熒光顯微鏡觀察（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射光512 nm）。注意事項：①Calcein-AM可能水解，因此水溶液需在1 d內(nèi)使用，DMSO溶液-20℃保存；②在室溫下解凍，在打開前短暫離心，重新凍存前密封所有的儲存液；③在檢測前需將細(xì)胞洗滌以去除或稀釋血清酯酶活性（通常在血清培養(yǎng)基中存在，因血清酯酶可導(dǎo)致胞外熒光的升高）。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長情況

初接種的細(xì)胞種類較多，倒置顯微鏡下可見滿視野圓形且折光性較強(qiáng)的細(xì)胞，其中多數(shù)為紅細(xì)胞，不貼壁，3 d后半量換液，由于紅細(xì)胞減少，可見少量的貼壁細(xì)胞，呈棒狀或紡錘狀。7 d后全量換液，瓶內(nèi)見多個細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞多伸展為長梭形。10 d后，克隆增大與其他克隆逐漸融合。隨著換液次數(shù)的增加懸浮不貼壁的細(xì)胞逐漸被清除，少數(shù)夾雜生長。以后3 d換一次培養(yǎng)液。到第14天，貼壁細(xì)胞幾乎90%匯合（圖1A）。

2.2 脂肪干細(xì)胞的生長情況

脂肪組織經(jīng)0.1%Ⅰ型膠原酶消化、紅細(xì)胞裂解液裂解后，可得到均一乳白色細(xì)胞。接種后5～7 h，部分細(xì)胞開始貼壁并開始伸出偽足，變?yōu)榧忓N形或長梭形，24 h后細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞呈纖維樣細(xì)胞生長，48 h后，細(xì)胞開始增殖，3～5 d達(dá)到增殖高峰，呈集落樣生長，在6～8 d后達(dá)到80%左右融合。從第2代開始，細(xì)胞貼壁時間和增殖時間明顯加快，2 h內(nèi)細(xì)胞均已貼壁，48 h后細(xì)胞可達(dá)到80～90%融合。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，細(xì)胞仍然保持旺盛的增殖能力和均一的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)特征（圖1B）。

2.3 滑膜干細(xì)胞的生長情況

原代SMSCs接種24 h后可見細(xì)胞貼壁，形態(tài)細(xì)長或為多角形，48 h后細(xì)胞數(shù)量增多，至72 h后便可見大量的紡錘形細(xì)胞，其中散在分布少許小圓形細(xì)胞。5 d左右可見細(xì)胞克隆形成（圖1C）。

2.4 三種細(xì)胞系的生長情況

C3H10T1/2，C2C12，NIH/3T3三種細(xì)胞系均具有繁殖快、生長密度大的特點(diǎn)，一般2～3 d即可長滿，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，需傳代于新的培養(yǎng)瓶中，一般傳代比例為1∶3或1:4（圖2）。

2.5 微囊的制備

利用高壓靜電裝置制造的微囊，無論是包裹細(xì)胞的還是未包裹細(xì)胞的，微囊形態(tài)大小基本一致，直徑基本在200μm左右（圖3）。

2.6 微囊內(nèi)細(xì)胞的存活

EB/Calcein-AM染色結(jié)果顯示，微囊內(nèi)各種細(xì)胞在1周及4周的存活率都比較高，基本未看到死亡的細(xì)胞（圖4、5）。

圖1 不同來源成體干細(xì)胞的形態(tài)，均可見集落形成單位（標(biāo)尺單位：20μm）Fig.1 Themorphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony form ing unit(Scale:20μm)

圖2 不同細(xì)胞系的生長形態(tài)（標(biāo)尺單位：20μm）Fig.2 The m orphology of different cell lines(Sca le:20μm)

圖3 海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態(tài)（標(biāo)尺單位：100μm）Fig.3 Themorphology of alginate-poly-L-lysine-alginatem icrocapsules(Scale:100μm)

圖4 不同組織來源的干細(xì)胞微囊包裹1周和4周后的存活情況（綠色指示的是存活細(xì)胞，紅色指示的是死亡細(xì)胞；標(biāo)尺單位：20μm）Fig.4 The viability of different tissue derived cells at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence indicates dead cells;Scale:20μm)

圖5 不同細(xì)胞系在微囊包裹1周和4周后的存活情況（綠色指示的是存活細(xì)胞，紅色指示的是死亡細(xì)胞；標(biāo)尺單位：20μm）Fig.5 The viability of d ifferent cell lines at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence ind icates dead cells;Scale:20μm)

3 討論

Friedenstein等最早確認(rèn)骨髓內(nèi)含有的成纖維樣細(xì)胞具備多向分化潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞甚至是成肌細(xì)胞。他們將全骨髓放置在塑料的培養(yǎng)皿中，并且在4 h后去除非黏附的大部分造血細(xì)胞。這些細(xì)胞在經(jīng)過數(shù)次傳代之后，在形態(tài)上更均一，更類似成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞因具有分化成不同種類的間充質(zhì)細(xì)胞的能力，被稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），又因被發(fā)現(xiàn)起源于骨髓內(nèi)復(fù)雜的支持結(jié)構(gòu)[2-6]，又被稱作骨髓基質(zhì)細(xì)胞。MSCs和 MSCs樣細(xì)胞現(xiàn)在已經(jīng)可以自骨髓外的多個部位分離得到，包括脂肪組織、羊水、滑膜、骨膜以及胚胎組織，其表型并不均一[7-11]。國際細(xì)胞治療學(xué)會（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）已制定了表征MSCs的最主要標(biāo)準(zhǔn)，包括①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下貼壁生長的能力；②特定的表面分子表達(dá)，95%以上的細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90（Thy-1）和CD105，不超過2%的細(xì)胞表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志，即CD34、CD45、CD11b或CD14、CD19或CD79a等；③具備向骨、軟骨和脂肪至少三個方向上的分化能力[12]。

本研究中，我們使用了全骨髓培養(yǎng)法，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長的特性來分離MSCs。全骨髓培養(yǎng)法是一種保留紅細(xì)胞和其他各種細(xì)胞混合培養(yǎng)的方法，該方法由于維持了BMSCs原始的生活環(huán)境，有利于BMSCs的分化，且操作過程也較為簡便。研究中觀察到原代培養(yǎng)的BMSCs呈集簇狀克隆生長，傳代后細(xì)胞貼壁迅速，生長增殖旺盛，約2～3 d便可傳代一次，短期內(nèi)即可培養(yǎng)獲得大量細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞也同樣生長迅速，短期內(nèi)也能大量獲得。但是滑膜細(xì)胞的量較少，細(xì)胞獲取的時間比較長，這可能與大鼠滑膜組織較小有關(guān)。

為避免非自體干細(xì)胞可能引起的排異反應(yīng)，本研究中嘗試?yán)梦⒛z囊來包裹各種原代的干細(xì)胞和一些具備成骨分化潛能的細(xì)胞系。微囊表面有選擇性透過膜，可避免免疫系統(tǒng)對囊內(nèi)細(xì)胞的攻擊，而小分子的營養(yǎng)物質(zhì)和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物可以自由出入，這樣保證了微囊內(nèi)細(xì)胞的存活。在微囊的制備中，材料的選擇尤其重要。作為細(xì)胞移植的包封材料，一般要求具有優(yōu)良的生物相容性，長期的生物與機(jī)械穩(wěn)定性，一定的機(jī)械強(qiáng)度和良好的成膜性。細(xì)胞微囊?guī)缀蹙伤z制備而成。這是一類可在水中膨脹但不溶解的合成或天然聚合物材料。作為制備細(xì)胞微囊的理想材料，水凝膠應(yīng)該具有以下特性：①易于形成光滑透明的膠囊，可方便觀察膠囊內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)；②組織周圍的機(jī)械或摩擦刺激可以通過凝膠柔軟圓滑的特性而消除；③由于材料的親水性，在流體和組織周圍無界面張力，這樣可將蛋白吸附和細(xì)胞黏附減小到最低限度，使微囊具有良好的生物相容性；④水凝膠對低分子量營養(yǎng)物和代謝物具有較高通透性；⑤材料通過聚電解質(zhì)絡(luò)合原理在生理條件下成膜，反應(yīng)條件溫和，有利于移植細(xì)胞的活性保存。其中以Lim等[13]的APA（海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉）微囊制作方法在細(xì)胞移植中的應(yīng)用最多。

包裹細(xì)胞的APA微囊是以海藻酸鈉為核心，周圍包裹陽離子聚合物材料聚賴氨酸，外面再包裹海藻酸鈉制成。它具有制備條件溫和、生物相容性好的特點(diǎn)，目前關(guān)于細(xì)胞微囊的研究中有超過85%的文獻(xiàn)應(yīng)用了此種方法。與其他成囊方法相比，該方法所制得的微膠囊形狀規(guī)則呈球形、表面較光滑、均勻性較一致，特別適用于細(xì)胞的微囊化研究。2000年，李保國等[14]用高壓靜電法制作胰島細(xì)胞微膠囊取得成功。前期研究中，我們也嘗試用微囊來包裹骨髓MSCs并獲成功[1，15-16]。

據(jù)報道，微囊的大小與微囊內(nèi)細(xì)胞的存活也有關(guān)系，較小的微囊更能減少免疫細(xì)胞對于微囊的排斥反應(yīng)[17]。在將微囊植入體內(nèi)時，由于血管釋放營養(yǎng)和氧氣的最大有效距離為200μm[18]，為了能確保微囊內(nèi)的細(xì)胞獲得更多的營養(yǎng)和氧氣，縮短微囊與血管的距離顯得尤其重要，較小微囊內(nèi)的細(xì)胞更能夠得到長期的存活。Robitaille等[19]發(fā)現(xiàn)微囊內(nèi)細(xì)胞的死亡主要是由于營養(yǎng)不足，較大微囊(大于200μm)內(nèi)細(xì)胞死亡更多。Sugiura等[20]認(rèn)為微囊的直徑不要超過300～400μm。Zhang等[21]則認(rèn)為微囊的直徑應(yīng)在100μm左右，微囊內(nèi)細(xì)胞的存活會更好。但微囊過小其內(nèi)部能容納的細(xì)胞量也較少，本研究中制備的微囊大小直徑在200μm左右。研究結(jié)果證明，各種原代的干細(xì)胞與細(xì)胞系均可以在此APA微囊中長期存活。

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The Growth and Viability of Different Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells and Different Cell Lines in Microcapsules

ZHANG Shuhong,SHEN Yang,TANG Tingting.
Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedics,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:TANG Tingting(E-mail：tingtingtang@hotmail.com).

Objective To observe the growth and viability of different tissue derived mesenchymal stem cells and different cell lines in microcapsules and to provide the experimental basis for the establishment of the m icroencapsulated gene medicine strategy.Methods The bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),adipose-derived stem cells(ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells(SMSCs)were isolated from rat.These cells,along with the C3H10T1/2 cell lines, C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines,had been encapsulated in the alginate-poly-L-lysine-alginate(APA)microcapsules producing by high voltage electrostatic generator.The viability of cells in APA m icrocapsules were determ ined by EB/ Calcein-AM dyeing method.Results The survival rates of different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs,ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines were high at 1 week and 4 weeks after encapsulation.Conclusion Different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs, ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines could survive for a long time after encapsulation.

Microcapsules;Mesenchymal stem cells;Cell lines

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）03－0130－06

2012年4月5日；

2012年4月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.003

國家自然科學(xué)基金（30772183、81172549）；上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊（第一期）發(fā)展計劃；上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)（J50206）。

200011上海市上海市骨科內(nèi)植物重點(diǎn)實(shí)驗室，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科。

湯亭亭（E-mail：tingtingtang@hotmail.com）。