Indian Hedgehog在牽張力促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中的作用研究

韓磊 張曉玲 唐國華

（1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔正畸科，南京210025；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 口腔正畸科，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011）

牙槽骨和顱頜面骨是應(yīng)力豐富區(qū)，也是成骨細(xì)胞活躍區(qū)。在外界機(jī)械應(yīng)力刺激下，成骨細(xì)胞的增殖分化是骨組織發(fā)生適應(yīng)性改建和骨再生重建的源泉[1]。越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)牽張力是有效促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和功能的力學(xué)刺激。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)：與力學(xué)有關(guān)的信號包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1/2（extracellular regulated protein kinases-1/2，ERK-1/2）信號通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）信號通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號通路、鈣離子通道、Rho蛋白及相關(guān)蛋白激酶（Rho/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase，Rho/ROCK）通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）通路、Hedgehog通道、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路等?；仡櫯cHedgehog相關(guān)的一些研究，筆者了解到在脊椎動物中，Hedgehog（Hh）蛋白家族至少含有3種成員，分別為Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh）和Dersert Hedgehog（Dhh）[2]。所有的Hh蛋白均可通過自身裂解過程產(chǎn)生一個C末端和功能性N末端結(jié)構(gòu)域，并且裂解的部位相當(dāng)保守。Ihh與Shh的C末端有明顯的區(qū)別，而N端結(jié)構(gòu)93%一致，故兩者有相似的生物學(xué)作用[3]。Hh受體Patched（Ptch）為一類12通道的跨膜蛋白，Hedgehog信號的傳導(dǎo)通過Smoothened（Smo，一類G蛋白偶聯(lián)的多通道膜蛋白）而發(fā)揮作用。缺乏Hedgehog蛋白時，Smo與Ptch結(jié)合處于抑制狀態(tài)。當(dāng)Hedgehog蛋白與Ptch結(jié)合后導(dǎo)致Smo釋放，活性狀態(tài)的Smo激活目的基因的轉(zhuǎn)錄活性，最終誘導(dǎo)一系列下游信號分子的釋放，發(fā)揮其調(diào)控作用[3-4]。Hedgehog通道抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine，cy）是一種植物性甾體類生物堿，主要通過對抗Smo而抑制Hh信號通路[5]。Hedgehog信號參與調(diào)節(jié)骨的生長發(fā)育，其中Ihh對經(jīng)歷軟骨內(nèi)成骨的四肢骨及大部分顱面骨的作用明顯。Ihh在軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：Ihh在成骨細(xì)胞中也有表達(dá)[6]。同時研究表明：Ihh是一個機(jī)械傳導(dǎo)因子，在下頜前導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，牽張力會激發(fā)下頜髁突增殖層細(xì)胞Ihh的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞的增殖[7]?；诖?，筆者提出假設(shè)：Hedgehog信號可能在機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖中發(fā)揮調(diào)控作用。因此本實(shí)驗(yàn)的研究目的是通過建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)加力模型，研究牽張力下Hedgehog家族中Ihh對成骨細(xì)胞增殖的作用，從而探索機(jī)械應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

新生SD大鼠（中國科學(xué)院斯萊克動物中心），鼠N端Hedgehog重組蛋白（N-terminus Sonic Hedgehog，N-Shh）（R&D公司，美國），環(huán)巴胺（Biomol公司，美國），三氯化釓（GdCl3）、0.25%胰酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司，美國），α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），含100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素（Invitrogen公司，加拿大）的雙抗，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（Promega公司，美國），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），F(xiàn)lexcell 4000TM加力系統(tǒng)（Flexcell公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的分離鑒定 取出生不足24 h的新生SD大鼠，在無菌條件下獲取顱頂骨，采用次序性酶消化法分離成骨細(xì)胞[8-9]，加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的α-MEM培養(yǎng)基，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，次日吸去殘留骨片后隔日換液，細(xì)胞80%～90%匯合時傳為P1代。

1.2.2 成骨細(xì)胞加力 常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇，用含10%小牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）的α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，隔日換液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)85%匯合時，按照每個培養(yǎng)皿每平方厘米1×105個細(xì)胞傳代于Flexcell加力板上，細(xì)胞種板日標(biāo)記為0 d；培養(yǎng)24 h后，換無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞狀態(tài)同步化；重新加入10%FCS的α-MEM培養(yǎng)基之后，分別對成骨細(xì)胞施加變形率為3%和6%（頻率為0.5 Hz、1/2正弦波形）的循環(huán)式牽張力，作用時間分別為4、12、24、36、48、60、72 h；對照組成骨細(xì)胞未施加循環(huán)式牽張力。每個樣本有3個復(fù)孔。

1.2.3 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在3%和6%牽張應(yīng)變作用24 h后，在加力板內(nèi)加入固定液，顯微鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 成骨細(xì)胞增殖能力分析 對成骨細(xì)胞施加4、12、24、36、48、60、72 h的循環(huán)式牽張力，每個樣本有3個復(fù)孔，加力結(jié)束后收樣，通過MTT比色法檢測細(xì)胞的相對數(shù)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。選擇24 h的時間點(diǎn)對成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，在成骨細(xì)胞接種于Flexcell加力板的第2天分別加入100 ng·mL-1N-Shh和2.5 μmol·L-1cy后同步化處理，在加力前15 min分別加入10 μmol·L-1的GdCl3，加力結(jié)束后收樣檢測細(xì)胞相對數(shù)和細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 8.0軟件包對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞鑒定結(jié)果

取P2代細(xì)胞，培養(yǎng)1周后多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽性；經(jīng)含β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)，2周后可形成明顯的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色為鮮紅色，證實(shí)所獲得的成骨細(xì)胞具有體外成骨功能。

2.2 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

成骨細(xì)胞受到周期性牽張應(yīng)變作用后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。在3%牽張應(yīng)變作用24 h后，加力板邊緣原來呈現(xiàn)短梭形的成骨細(xì)胞被拉長，呈成行排列，與受力方向垂直；中間部分細(xì)胞仍呈不規(guī)則排列，但細(xì)胞體積增大。6%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞形態(tài)變化與受到3%牽張應(yīng)變類似。

2.3 成骨細(xì)胞增殖能力分析

2.3.1 不同大小牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，3%牽張應(yīng)變作用12、24、36、48 h后，加力組較對照組成骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在加力60、72 h后，2組細(xì)胞數(shù)目間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。6%牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞數(shù)目的變化趨勢與3%類似（圖2）。流式細(xì)胞儀定量檢測顯示，3%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞進(jìn)入S期的比例在加力24和48 h后分別比對照組增加了70%和20%；6%牽張應(yīng)變作用下成骨細(xì)胞進(jìn)入S期的比例在24和48 h后分別比對照組增加了80%和35%。

圖2 牽張應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 2 The effect of stretching force on cell proliferation

施加牽張應(yīng)變24 h后，與3%牽張應(yīng)變相比，6%牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更明顯（圖3、4）。當(dāng)使用GdCl3處理后，3%和6%牽張應(yīng)變均不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖（圖3、4）。

2.3.2 Hedgehog在牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中的作用 對成骨細(xì)胞施加牽張應(yīng)變24 h，細(xì)胞周期檢測顯示，Hh通道抑制劑cy抑制了6%牽張應(yīng)變對S期比例的促進(jìn)作用，使S期比例降低了40%（圖5）；加入cy后，加力組較cy處理組在S期比例上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5），再加入機(jī)械通道抑制劑GdCl3后，更能抑制S期比例（P＜0.05，圖5）。加入Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh后，加力組較對照組S期比例升高（P＜0.05，圖6）。成骨細(xì)胞在受到6%牽張應(yīng)變后，加入N-Shh組與不加N-Shh組在S期比例上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖3 牽張應(yīng)變和GdCl3對成骨細(xì)胞數(shù)目的影響Fig 3 The effect of stretching force and GdCl3 on cell proliferation of osteoblasts

圖4 牽張應(yīng)變和GdCl3對細(xì)胞S期比例的影響Fig 4 The effect of stretching force and GdCl3 on S phase ratio

圖5 cy和GdCl3對牽張應(yīng)力下成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 5 The effects of cy and GdCl3 on the stretch induced proliferation of osteoblasts

圖6 N-Shh對牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞增殖的影響Fig 6 The effect of N-Shh on the stretch induced proliferation of osteoblasts

3 討論

成骨細(xì)胞是骨修復(fù)、重建過程中重要的功能細(xì)胞，具備增殖、分化、分泌骨細(xì)胞外基質(zhì)的能力[10-12]。牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的機(jī)理仍然不是很清楚。目前發(fā)現(xiàn)的與增殖激活有關(guān)的基因有c-Myc、c-Fos、c-Jun等[13-16]。先期研究發(fā)現(xiàn)：Ihh對軟骨內(nèi)成骨過程中成骨細(xì)胞的增殖是必需的。本研究發(fā)現(xiàn)：Ihh參與了成骨細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖兩種過程。作用于成骨細(xì)胞的牽張力經(jīng)過一系列信號傳導(dǎo)促進(jìn)Ihh信號的表達(dá)，Ihh信號進(jìn)一步介導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖。

本實(shí)驗(yàn)采用的Flexcell 4000TM系統(tǒng)能夠?qū)討B(tài)的、可控性強(qiáng)的力學(xué)信號作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示加力板邊緣的成骨細(xì)胞受到單軸牽張力，而加力板中央的大部分成骨細(xì)胞受到等軸牽張力。Flexcell 4000TM系統(tǒng)所施加的力學(xué)信號主要有力值大小、頻率、波形、作用時間4個重要的參數(shù)。從模擬生理環(huán)境的角度，本實(shí)驗(yàn)采用了中度變形幅度（3%和6%）、低頻（0.5 Hz）間斷刺激[10-12]。生理情況下的力通常是由無到最大值一個連續(xù)緩慢的變化過程，所以采用1/2正弦波形。在牽張應(yīng)變作用48 h內(nèi)，加力組較對照組成骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加，而在加力60、72 h后，2組細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與成骨細(xì)胞對周期性牽張應(yīng)力的作用時間（或總周期數(shù)）具有“扳機(jī)點(diǎn)”效應(yīng)有關(guān)[11]。對成骨增殖周期進(jìn)行定量檢測結(jié)果顯示：受到牽張應(yīng)變后，成骨細(xì)胞處于S期比例的細(xì)胞數(shù)目增多，牽張應(yīng)力能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并且此促進(jìn)作用主要發(fā)生在48 h內(nèi)，6%牽張應(yīng)變對成骨細(xì)胞刺激較3%牽張應(yīng)變更明顯，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，主要選取24 h，6%牽張應(yīng)變的參數(shù)。GdCl3被認(rèn)為是特異性的機(jī)械通道抑制劑[17]。當(dāng)先使用GdCl3后再施加牽張力，3%和6%牽張應(yīng)變均不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果均證實(shí)牽張應(yīng)變能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

筆者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：變形率為6%的牽張應(yīng)變作用于成骨細(xì)胞4、12、24 h后，Hedgehog家族中的Ihh基因表達(dá)分別增加了20%、110%和50%，6%的牽張應(yīng)變較3%牽張應(yīng)變對Ihh基因表達(dá)的促進(jìn)作用更明顯。這提示Hedgehog家族中的Ihh信號對力學(xué)刺激敏感。使用GdCl3阻斷牽張力通道，GdCl3能完全抑制牽張力對Ihh表達(dá)的促進(jìn)作用。這提示Ihh基因?qū)αW(xué)刺激敏感，牽張應(yīng)變通過成骨細(xì)胞膜表面的機(jī)械力通道調(diào)節(jié)Ihh基因的表達(dá)?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究Ihh信號與牽張應(yīng)變下成骨細(xì)胞增殖間的關(guān)系。

為了揭示Ihh信號在牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖中的作用，筆者分別觀察了Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh、Hh通道抑制劑cy以及機(jī)械通道抑制劑GdCl3對牽張應(yīng)力下成骨細(xì)胞增殖的影響。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)：N-Shh干預(yù)成骨細(xì)胞后，其數(shù)目及處于增殖期（S期）的細(xì)胞比例增多[6]。而經(jīng)過cy處理后的細(xì)胞數(shù)量和S期細(xì)胞數(shù)均明顯減少。這提示：Hedgehog信號促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Hedgehog通道抑制劑cy不但阻斷了6%牽張應(yīng)變對S期比例的促進(jìn)作用，而且使S期比例降低了40%，這與前期的研究結(jié)果一致[6]，同時也提示cy對成骨細(xì)胞增殖的抑制作用大于牽張力的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步研究Ihh是否是牽張應(yīng)力促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的唯一途徑，分別加入cy和（或）GdCl3。加入cy后再施加牽張力仍然能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但這種促進(jìn)作用能被GdCl3抑制，這提示Ihh并非是牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的唯一途徑，牽張力還可能通過其他通路或因子促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。

此外，加入Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh后，加力組較對照組成骨細(xì)胞增殖增加，這也進(jìn)一步支持了牽張應(yīng)變促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的傳導(dǎo)通道可能涉及眾多的通路或因子，而Ihh僅僅是其中之一；Hh通道增強(qiáng)劑N-Shh和力學(xué)刺激共同作用也并不比單獨(dú)力學(xué)刺激更能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。這提示牽張力和N-Shh在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖上并無協(xié)同作用。

綜上所述，Ihh參與了牽張力對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)；Hedgehog通路是參與應(yīng)力對成骨細(xì)胞增殖調(diào)控的通道之一。對Hedgehog信號的調(diào)控，可能成為促進(jìn)骨形成和骨修復(fù)的又一有效途徑。

[1]Skerry TM.The response of bone to mechanical loading and disuse：Fundamental principles and influences on osteoblast/osteocyte homeostasis[J].Arch Biochem Biophys,2008,473（2）：117-123.

[2]St-Jacques B,Hammerschmidt M,McMahon AP.Indian hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of chondrocytes and is essential for bone formation[J].Genes Dev,1999,13（16）：2072-2086.

[3]Jemtland R,Divieti P,Lee K,et al.Hedgehog promotes primary osteoblast differentiation and increases PTHrP mRNA expression and iPTHrP secretion[J].Bone,2003,32（6）：611-620.

[4]van den Heuvel M,Ingham PW.Smoothened encodes a receptorlike serpentine protein required for hedgehog signalling[J].Nature,1996,382（6591）：547-551.

[5]Incardona JP,Gaffield W,Lange Y,et al.Cyclopamine inhibition of Sonic hedgehog signal transduction is not mediated through effects on cholesterol transport[J].Dev Biol,2000,224（2）：440-452.

[6]韓磊,張曉玲,李晅,等.Hedgehog通路對成骨細(xì)胞增殖和分化的作用研究[J].上?？谇会t(yī)學(xué),2009,18（3）：287-290.

Han Lei,Zhang Xiaoling,Li Xuan,et al.Hedgehog pathway is associated with the proliferation and differentiation of osteoblasts[J].Shanghai J Stomatol,2009,18（3）：287-290.

[7]Tang GH,Rabie AB,H?gg U.Indian hedgehog：A mechanotransduction mediator in condylar cartilage[J].J Dent Res,2004,83（5）：434-438.

[8]鄂玲玲,劉洪臣,王東勝.貼壁組織塊反復(fù)消化法培養(yǎng)新生大鼠下頜骨成骨細(xì)胞及鑒定[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,27（2）：130-134.

E Lingling,Liu Hongchen,Wang Dongsheng.Primary culture and identification of neonatal rat’s mandibular osteoblasts with modified repeating enzymatic digestion-adherent explants method[J].West China J Stomatol,2009,27（2）：130-134.

[9]李良,鄧力,陳孟詩,等.力學(xué)刺激對3月齡骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞增殖與合成功能的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2004,23（2）：341-346.

Li Liang,Deng Li,Chen Mengshi,et al.The effect of mechanical stimulation on the proliferation and synthetic function of osteoblasts from osteoporotic rat[J].J Biomed Eng,2004,23（2）：341-346.

[10]Mikuni-Takagaki Y,Suzuki Y,Kawase T,et al.Distinct responses of different populations of bone cells to mechanical stress[J].Endocrinology,1996,137（5）：2028-2035.

[11]Jaasma MJ,Jackson WM,Keaveny TM.The effects of morphology,confluency,and phenotype on whole-cell mechanical behavior[J].Ann Biomed Eng,2006,34（5）：759-768.

[12]Stanford CM,Morcuende JA,Brand RA.Proliferative and phenotypic responses of bone-like cells to mechanical deformation[J].J Orthop Res,1995,13（5）：664-670.

[13]Fournier HN,Dupé-Manet S,Bouvard D,et al.Nuclear translocation of integrin cytoplasmic domain-associated protein 1 stimulates cellular proliferation[J].Mol Biol Cell,2005,16（4）：1859-1871.

[14]Shur I,Lokiec F,Bleiberg I,et al.Differential gene expression of cultured human osteoblasts[J].J Cell Biochem,2001,83（4）：547-553.

[15]張西正,郭勇,李瑞欣,等.單向交變拉伸應(yīng)變及壓應(yīng)力對大鼠成骨細(xì)胞FOS蛋白表達(dá)及細(xì)胞定位的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006,23（2）：326-328.

Zhang Xizheng,Guo Yong,Li Ruixin,et al.Influence of stretch strain and pressure on expression of osteoblasts’FOS protein[J].J Biomed Eng,2006,23（2）：326-328.

[16]Shevde NK,Bendixen AC,Dienger KM,et al.Estrogens suppress RANK ligand-induced osteoclast differentiation via a stromal cell independent mechanism involving c-Jun repression[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97（14）：7829-7834.

[17]Wu X,Walker J,Zhang J,et al.Purmorphamine induces osteogenesis by activation of the hedgehog signaling pathway[J].Chem Biol,2004,11（9）：1229-1238.