4種甜蕎麥黃酮提取方法的比較研究

張素斌 廖燕婷

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

蕎麥為蓼科蕎麥屬雙子葉1年生作物，生產(chǎn)上栽培的主要有甜蕎麥和苦蕎麥，而世界性蕎麥多指甜蕎［1］。蕎麥是營養(yǎng)豐富的糧食作物，蛋白質(zhì)、維生素、微量元素含量均超過大米，尤其含有其它糧食作物所缺乏的黃酮類化合物，而黃酮類化合物具有降血脂、降血糖等功能，并對糖尿病、高血壓、冠心病、中風(fēng)等疾病有輔助療效，它還是一種天然抗氧化劑，具有清除氧自由基、抗衰老的作用［2］。

研究提取蕎麥中黃酮類物質(zhì)的最有效的方法，能更好地利用蕎麥資源。目前用于蕎麥及其附產(chǎn)物中黃酮的提取方法有乙醇浸提法［3］、超聲波法［4］、纖維素酶法［5］等，但對同一種原料采用幾種不同方法提取鮮見報道。本試驗采用乙醇提取法、超聲波輔助法、纖維素酶輔助法、超聲纖維素酶輔助法這4 種方法分別提取甜蕎麥中黃酮類化合物，利用NaNO2－Al（NO3）3比色法測定黃酮類化合物，探討這幾種方法提取甜蕎麥黃酮的最佳工藝并對這幾種方法的黃酮提取率進行比較，以期得出最佳的提取工藝，為甜蕎麥的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

甜蕎麥：產(chǎn)地為內(nèi)蒙古通遼，購于肇慶大潤發(fā)超市。

蘆丁標準樣：中國藥品生物制品檢定所；

纖維素酶：酶活力為2 000IU／g，北京鴻潤寶順科技有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

氫氧化鈉：分析純，天津市廣成化學(xué)試劑廠；

試驗用水：去離子水，本實驗室使用離子交換樹脂純水器制備；

離子交換樹脂純水器：PWG－100，北京新華教儀科貿(mào)公司；

臺式超聲清洗儀：SK8200H，上海市科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV／VIS 916，澳大利亞GBC 科學(xué)儀器公司；

可見分光光度計：S22PC，上海棱光技術(shù)有限公司；

恒溫水浴鍋：H－S2系列，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；

電子分析天平：AUY120，Shimadzu Corporation Janpan；

酸度計：PHS－29A 型，上海大普儀器有限公司；

數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：DHG－9070B型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 將蕎麥粒粉碎，過40目篩，在65～70 ℃烘干至恒重，密封備用。

1.2.2 測定波長的選擇與標準曲線的繪制 用30%乙醇溶液配制濃度為0.472 2mg／mL的蘆丁標準溶液，置于冰箱中避光冷藏。吸取蘆丁標準溶液2mL，置于10mL 刻度試管中。加5% NaNO2水溶液0.4 mL，放置6 min，加10% Al（NO3）3水溶液0.4mL，放置6min，加1.0mol／L NaOH 水溶液4.0mL，加30%乙醇至刻度，搖勻。放置15min后，于分光光度計上在400～600 nm 掃描吸收光譜，結(jié)果在510nm處有最大吸收峰，故選定510nm 作為測定波長。

準確吸取蘆丁標準溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.8，1.0，1.5mL 于8只10mL 刻度試管中，按上述方法顯色定容，在510nm 處測定其吸光度。以吸光度A 為縱坐標，溶液質(zhì)量濃度ρ（mg／mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程A＝12.395ρ－0.025，r ＝0.997。

1.2.3 蕎麥黃酮的提取與計算 準確稱取適量蕎麥粉放入錐形瓶中，分別采用乙醇提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶輔助提取法、超聲纖維素酶輔助提取法提取甜蕎麥中黃酮物質(zhì)，將提取液冷卻至室溫，定容，過濾，吸取濾液1～3mL，放入10 mL 刻度試管中，按1.2.2 所述方法用NaNO2－Al（NO3）3比色法測定黃酮類物質(zhì)。對幾種方法的提取工藝進行優(yōu)化并對黃酮提取率進行比較，以黃酮含量為評價指標，計算公式如下：

式中：

R—— 黃酮含量，%；

ρ—— 從標準曲線查得的黃酮含量，mg／mL；

n—— 樣品提取液的稀釋倍數(shù)；

m—— 樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取法

影響蕎麥黃酮提取率的因素有很多，包括提取溶劑種類、料液比、提取溫度和時間等，文獻［3，6，7］多選擇乙醇作為提取劑，液固比1∶10～1∶50（m∶V），乙醇濃度50%～80%，溫度70～80 ℃，時間2.5～9.0h。根據(jù)文獻［3］、［6］和［7］，本試驗按以下條件進行試驗：準確稱取2g蕎麥粉，按料液比為1∶15（m∶V）的比例加入65%乙醇，在70℃下恒溫水浴浸提6h，以下按1.2.3所述方法進行測定，測得蕎麥中黃酮含量為0.564%。

2.2 超聲波輔助法

采用功率為500 W 的超聲清洗儀進行超聲輔助提取蕎麥黃酮，參考文獻［8］，以黃酮含量為評價指標，選擇料液比、乙醇濃度、超聲提取時間3個因素進行研究，用L9（34）正交表安排試驗（表1）。超聲提取后，按1.2.3所述方法進行測定。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 超聲波輔助法正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment on ultrasonic wave－assisted extraction

表2 超聲波輔助法正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 2 Design and results of orthogonal test on ultrasonic wave－assisted extraction

由表2 可知，超聲法的最佳提取條件為A2B3C2，即以75%的乙醇為提取液，蕎麥粉與乙醇用量的料液比為1∶15（m∶V），超聲提取30min。從極差分析可知，各因素對黃酮提取率的影響順序為乙醇濃度＞料液比＞提取時間，其中乙醇濃度的影響最大，但當(dāng)乙醇濃度從65%增加到75%時，黃酮含量的增加幅度小于5%，即乙醇濃度的增加對指標的影響趨于平緩。而料液比與提取時間對指標的影響較小。在最佳條件下進行驗證實驗，測得蕎麥中黃酮含量為0.633%。

2.3 纖維素酶輔助法

采用纖維素酶輔助法提取蕎麥黃酮，酶解作用在醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中進行（m樣品∶V緩沖溶液＝1∶15），參考文獻［9］、［10］，以黃酮含量為評價指標，考察影響纖維素酶作用的4 個主要因素：酶解溫度、酶解時間、加酶量和酶解pH值，選用L9（34）正交表安排試驗（表3），酶水解后將提取液的乙醇濃度調(diào)為75% （此時m樣品：V75%乙醇 ＝1∶71），在70 ℃下浸提1h，以下按1.2.3所述方法進行測定。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

由表4可知，纖維素酶輔助法的最佳提取條件為A2B3C2D3，即酶解溫度為50 ℃，酶解時間為3h，纖維素酶量為1%，酶解pH 為5.5。從極差分析可知，各因素對黃酮提取率的影響順序為酶解pH 值＞酶解時間＞酶解溫度與加酶量，酶解pH 值與酶解時間對結(jié)果影響較大，酶解溫度與加酶量對結(jié)果影響較小。在最佳條件下進行驗證性實驗，測得蕎麥黃酮含量為0.575%。

表3 纖維素酶輔助法正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment on cellulase－assisted extraction

表4 纖維素酶輔助法正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 4 Design and results of orthogonal test on cellulase－assisted extraction

2.4 超聲纖維素酶輔助法

［11］、［12］以及2.3的試驗結(jié)果，采用先超聲后纖維素酶水解的輔助提取法，選用pH 為5.5的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液作為超聲與酶解的介質(zhì)，固定超聲功率為500 W，加酶量為1%，酶解溫度為50 ℃，以黃酮含量為評價指標，研究料液比、超聲時間、酶水解時間和乙醇提取時間對結(jié)果的影響，選用L9（34）正交表安排試驗（表5），酶水解后將提取液的乙醇濃度調(diào)為75%，在70 ℃下浸提，以下按1.2.3所述方法進行測定。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

表5 超聲纖維素酶輔助法正交試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of orthogonal experiment on ultrasonic wave－assisted and cellulase－assisted extraction

表6 超聲纖維素酶輔助法正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析Table 6 Design and results of orthogonal test on ultrasonic wave－assisted and cellulase－assisted extraction

由表6可知，超聲纖維素酶輔助法的最佳提取條件為A1B3C1D3，即料液比為1∶10（m∶V），超聲時間為40min，酶解時間為30min，在70 ℃下用乙醇提取的時間為1.5h。從極差分析可知，各因素對黃酮提取的影響順序為乙醇提取時間＞超聲時間與料液比＞酶解時間。按最佳條件進行驗證性實驗，測得蕎麥黃酮含量為0.853%。

3 結(jié)論

經(jīng)試驗研究，乙醇提取法在乙醇濃度為65%、料液比1∶15（m∶V）及70 ℃溫度條件下提取6h，總黃酮得率為0.564%。超聲波輔助法在乙醇濃度為75%、料液比1∶15（m∶V）、超聲30min時總黃酮得率為0.633%。纖維素酶輔助法在料液比1∶15（m∶V），1%的纖維素酶，50 ℃下酶解3h，酶水解后70 ℃下用75%乙醇浸提1h，總黃酮得率為0.575%。超聲纖維素酶輔助法在料液比1∶10（m∶V），先超聲40min，再酶解30 min，在70 ℃下用75%乙醇提取1.5h，總黃酮得率為0.853%。

比較以上4種提取工藝的甜蕎麥總黃酮提取率，乙醇提取法時間最長，但與纖維素酶輔助法提取率相差不大，而文獻［5］（原料為蕎麥莖葉）則認為纖維素酶輔助法的黃酮提取率有較大提高，這可能與原料不同有關(guān)。超聲波輔助法的黃酮提取率稍高，但提取時間最短，本試驗的結(jié)論與文獻［7］（原料為甜蕎麥麩皮）、［8］（原料為苦蕎）的結(jié)論一致，文獻［13］（原料為苦蕎）則認為超聲波輔助法與乙醇提取法的提取效果差異不顯著。超聲纖維素酶法具有明顯的優(yōu)勢，黃酮提取率高，提取時間比乙醇浸提法與纖維素酶法短，是一種較好的蕎麥黃酮提取方法。超聲纖維素酶輔助法所得黃酮含量較高，可能是由于超聲波的熱效應(yīng)、機械粉碎作用和空化作用［13］，而纖維素酶可以破壞細胞壁，有利于內(nèi)容物的釋放［5］，二者的協(xié)同作用，可使樣品中黃酮物質(zhì)與其它成分的分離更徹底，與溶劑的接觸面更廣，因而更容易溶于乙醇中。由文獻［11］、［12］及本試驗結(jié)果表明，超聲及纖維素酶的協(xié)同作用確實有利于提高植物類樣品中黃酮類物質(zhì)的提取率。

今后還有必要對不同方法提取的甜蕎麥總黃酮的組成、結(jié)構(gòu)以及純化進行深入研究。

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