松籽殼多糖超聲輔助溶劑法提取及抗氧化性研究

李桂娟 李 沖 姜 雪 龔 偉 張財華 楊 麗

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 長春 130012）

松籽殼是松籽加工的副產(chǎn)品，中國每年大約產(chǎn)松籽殼500萬t，但松籽殼開發(fā)利用較低，僅有從松籽殼中提取黃酮和將松籽殼制備成活性炭的報道［1，2］。松籽殼多糖（pine nut shell polysaccharide，PSP）是從松籽殼中提取的一種酸性多糖。研究［3，4］表明，從天然產(chǎn)物中提取出來的多糖能參與生物體內(nèi)細胞中的各種活動，具有重要與特殊的生理活性。在提高人體免 疫力和 抗 衰 老［5，6］、抗 腫 瘤、抗 病 毒［7，8］、抗 感 染、抗凝血、抗氧化［9］、降血糖、調(diào)血脂［10］等方面都表現(xiàn)出顯著的藥理作用與藥用療效［11］。多糖的抗氧化研究［12］表明，多糖的抗氧化性可能是多糖抗腫瘤、抗衰老、抗感染等其它活性的重要原理之一。近年來利用超聲法提取植物中的多糖受到人們的關(guān)注［13，14］，但關(guān)于松籽殼多糖的提取和抗氧化性的研究還鮮有報道。本試驗采用超聲波輔助溶劑法，通過單因素和正交試驗，對松籽殼中可溶性多糖的提取工藝進行研究，旨在探索松籽殼多糖的提取方法，分析其清除自由基的能力。為松籽殼多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究提供理論基礎(chǔ)，為松籽殼的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

松籽：購自吉林省長白縣農(nóng)貿(mào)市場；

無水乙醇、苯酚：AR 級，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；

乙醚：AR 級，天津天泰精細化學(xué)品有限公司；

濃硫酸、碳酸氫鈉、正丁醇、三氯甲烷：AR 級，北京北化精細化學(xué)品有限責(zé)任公司；

葡萄糖：AR 級，北京化工廠；

水楊酸：AR 級，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

七水合硫酸亞鐵、過氧化氫：天津市福晨化學(xué)試劑廠；

鄰苯三酚：天津市光復(fù)精細化工研究所；

氯化硝基四唑氮藍（NBT）：?；菔郎噭┯邢薰荆?/p>

三羥甲基氨基甲烷（Tris）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速萬能粉碎機：FW－100，北京中興偉業(yè)儀器公司；

電熱恒溫水浴鍋：TMTE－7000，余姚市長江溫度儀表廠；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ－300DE，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV754N，蘇州江東精密儀器有限公司；

電子天平：ML203，梅特勒托利多（上海）儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：DF206，上?；|儀器設(shè)備有限公司；

離心機：LGR10－4.2，北京醫(yī)用離心機廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE1002，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；

電動攪拌器：JJ－1，金壇市恒斗儀器廠；

循環(huán)水多用真空泵：SHB－Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助溶劑法提取工藝流程

松籽殼去雜質(zhì)→粉碎→過篩→干燥→乙醇乙醚混合溶液脫脂→干燥→超聲提取→過濾→濃縮→加入無水乙醇→靜置→離心沉淀→干燥→粗多糖

1.2.2 熱水提取法工藝流程 熱水提取法工藝流程與1.2.1基本相同，不同的是超聲提取工藝改為熱水提取。

1.2.3 原料預(yù)處理 去除果仁和雜質(zhì)后的松籽殼用粉碎機粉碎，過80目篩，置于干燥箱中50 ℃烘干。取適量干燥后的松籽殼粉，用配好的乙醇∶乙醚（V∶V）1∶1混合溶劑按料液比為1∶3（m∶V）浸泡，于三口燒瓶中60 ℃加熱回流1h，過濾，所得濾渣烘干，備用。

1.2.4 多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸法［15］。

1.2.5 超聲波輔助提取工藝單因素試驗

（1）提取時間對多糖含量的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶40（m∶V），提取溫度60 ℃，提取功率450 W，分別提取10，20，30，40，50 min，考察提取時間對松籽殼多糖含量的影響。

（2）提取溫度對多糖含量的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶40（m∶V），提取功率450 W，提取時間15min，在溫度分別為50，60，70，80 ℃條件下進行提取，考察提取溫度對松籽殼多糖含量的影響。

（3）料液比對多糖含量的影響：提取次數(shù)3次，提取溫度60 ℃，提取功率450 W，提取時間15 min，在料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（m∶V）條件下進行提取，考察料液比對松籽殼多糖含量的影響。

（4）提取次數(shù)對多糖含量的影響：提取次數(shù)3次，料液比1∶40（m∶V），提取溫度60 ℃，提取功率450 W，提取時間15min，提取3次，考察提取次數(shù)對松籽殼多糖含量的影響。

1.2.6 抗氧化性能研究試驗

（1）清除羥基自由基試驗：取5 支具塞試管，分別標(biāo)號1，2，3，4，5。分別向試管中依次加入6mmol／L FeSO4溶液2mL、不同質(zhì)量濃度的松子殼多糖溶液2 mL，6 mmol／L H2O2溶液2mL，搖勻，靜置10min，再加入6mmol／L 水楊酸溶液2mL，搖勻，靜置30min后于510nm 處測定不同質(zhì)量濃度下松子殼多糖的吸光度值（Ai）。

另取5支具塞試管，標(biāo)號為1′，2′，3′，4′，5′。用水代替水楊酸，重復(fù)上述操作，測定某質(zhì)量濃度下松子殼多糖的吸光度值（Aj）。

再取1支具塞試管，標(biāo)號為0。用水代替抗氧化劑，測得空白對照吸光光度值（Ao）。

按式（1）計算羥基自由基清除率：

式中：

E—— 清除率，%；

Ai—— 松籽殼多糖吸光度；

Aj—— 松籽殼多糖本底吸光度；

Ao—— 空白對照吸光度。

（2）清除超氧陰離子試驗：取5 支具塞試管，分別標(biāo)號1，2，3，4，5。分別取0.1mol／L pH 為8.2的Tris－HCl緩沖液2.5mL于試管中，置25 ℃水浴中預(yù)熱20min，加不同質(zhì)量濃度的松子殼多糖溶液0.2mL，0.98mmol／L 的NBT 0.6mL，10 mmol／L 的 鄰 苯 三 酚0.3 mL，混 合 均 勻 后 在25 ℃水浴中反應(yīng)4min，立即用2滴8mol／L的0.1mL HCl終止反應(yīng)，并在波長為530nm 處測定吸光度A 值。

另取5 支具賽試管分別標(biāo)號1′，2′，3′，4′，5′作為空白組，空白管用蒸餾水代替松子殼多糖溶液。重復(fù)上述步驟。

按式（2）計算超氧陰離子基清除率：

式中：

E—— 清除率，%；

Ab—— 空白樣品吸光度；

As—— 樣品吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲提取時間對松籽殼多糖含量的影響 由圖1可知，在10～30min時，提取物中多糖的含量隨著超聲提取時間的增加而明顯提高，30min之后，隨著超聲提取時間的增加，提取物中多糖的含量下降。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是隨著時間的增加，松籽殼細胞膜的破碎度逐漸增大，溶出物的含量也隨之增多，多糖含量增加。隨著時間的進一步增加，當(dāng)溶解度達到飽和時，有效成分不再被溶解，產(chǎn)率也就不再有明顯提高。隨著超聲時間的延長，雜質(zhì)的含量相應(yīng)增多，有效成分的溶解量隨之減少，即提取物中的多糖含量隨之減小。因此選取30min為最佳超聲提取時間。

2.1.2 超聲提取溫度對松籽殼多糖含量的影響 由圖2可知，提取溫度低于60 ℃時，松籽殼多糖的含量隨著溫度的升高而迅速增大，這可能是溫度較低時，一部分胞壁結(jié)構(gòu)未受到根本性破壞，而僅發(fā)生變形和裂紋，而隨著溫度的提高，熱效應(yīng)使分子的運動加速，進一步破壞了胞壁結(jié)構(gòu)，從而使松籽殼中水溶性多糖得到更充分的釋放，溫度超過60 ℃后，松籽殼提取物中的多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢。分析原因，可能是溫度高于60 ℃后，在高溫和超聲波剪切的協(xié)同作用下，使部分松籽殼多糖受到破壞，導(dǎo)致松籽殼提取物中多糖的含量減少。所以選取60 ℃為最佳超聲提取溫度。

圖1 超聲提取時間與多糖含量的關(guān)系曲線Figure 1 Ultrasonic extraction time and the curve of the polysaccharide content

圖2 超聲提取溫度與多糖含量的關(guān)系曲線Figure 2 Ultrasonic extraction temperature and the curve of the polysaccharide content

2.1.3 料液比對松籽殼多糖含量的影響 由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶20～1∶30（m∶V）時，松籽殼提取物中多糖的含量隨著料液比的增加而逐漸提高，料液比為1∶40（m∶V）時出現(xiàn)最大值。這是因為隨著料液比的增大，松籽殼多糖含量將逐漸增大，雜質(zhì)的含量也將增大，但料液比達到一定值后，雜質(zhì)的去除效率將明顯影響提取物中多糖含量，因而選取1∶40（m∶V）為最佳料液比。

2.1.4 超聲提取次數(shù)對松籽殼多糖含量的影響 由圖4可知，松籽殼提取物中多糖的含量隨著超聲提取次數(shù)的增加而提高，提取次數(shù)從1次增加到2次時多糖提取率上升明顯，從2次增加到3次時松籽殼提取物中多糖的提取率趨于平緩，所以從經(jīng)濟合理性考慮，選取超聲提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對影響松籽殼多糖提取率的主要因素（超聲次數(shù)、料液比、提取時間和提取溫度）進行L9（34）正交試驗研究，確定最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

圖3 料液比與多糖含量的關(guān)系曲線Figure 3 Solid－liquid ratio curve with the polysaccharide content

圖4 超聲提取次數(shù)與多糖含量的關(guān)系曲線Figure 4 Ultrasonic extraction times and the relationship of the polysaccharide content

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels for the L9（34）orthogonal design

由表2可知，超聲提取松籽殼多糖的最佳工藝條件為A3B2C3D1，即超聲提取時間為30 min，超聲提取溫度為60 ℃，超聲提取料液比為1∶50（m∶V），超聲提取次數(shù)為1次。此工藝下多糖提取率為44.26%。

在提取時間、提取溫度、料液比及超聲提取次數(shù)4個因素中，由極差值R 可知，對超聲提取物中多糖的含量的影響強弱順序為提取溫度＞提取次數(shù)＞提取料液比＞提取時間。

方差結(jié)果（表3）表明，B 因素對提取結(jié)果的影響顯著。即提取溫度影響最大，而提取時間、料液比和提取次數(shù)對結(jié)果無顯著影響。因此，考慮到工藝條件、生產(chǎn)效率、經(jīng)濟合理性等，確定超聲提取松籽殼多糖的最佳提取工藝條件：超聲提取時間為30min，超聲提取溫度為60 ℃，超聲提取料液比為1∶50（m∶V），超聲提取次數(shù)為1次。

表2 L9（34）正交試驗試驗結(jié)果Table 2 Results of L9（34）orthogonal experiments

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

2.3 超聲波輔助提取法和熱水提取法的比較

兩種提取方法對松籽殼多糖含量的影響見表4。由表4可知，超聲波輔助法提取不僅多糖含量高，提取時間短，而且超聲提取法溫度低于熱水浸提法，因此，超聲波輔助提取法不僅節(jié)省能源，更利于活性物質(zhì)的不變性與不失活。

表4 超聲波輔助提取與熱水浸提法結(jié)果的對比Table 4 Comparison of ultrasonic assisted extraction with hot water extraction results

2.4 松籽殼多糖抗氧化性研究

2.4.1 清除羥基自由基 由圖5可知，松籽殼多糖對羥基自由基具有清除能力，且清除能力的強弱與多糖濃度成正相關(guān)系。當(dāng)多糖濃度達到0.8mg／mL 時，松籽殼多糖的對羥基自由基的清除率就超過50%，這表明松籽殼多糖具有良好的清除羥基自由基的能力。

2.4.2 清除超氧陰離子自由基 由圖6可知，松籽殼多糖對超氧自由基具有一定程度的清除能力，且清除能力與多糖濃度呈正相關(guān)性。當(dāng)松籽殼多糖濃度達到2.2mg／mL 時松籽殼多糖對超氧陰離子基的清除率接近50%?？梢?，松籽殼多糖清除超氧自由基的能力與清除羥基自由基的能力相比較弱。

圖5 多糖濃度與羥基自由基清除率關(guān)系曲線Figure 5 The curve between polysaccharide concentration and hydroxyl radical scavenging rate

圖6 多糖濃度與超氧陰離子自由基清除率關(guān)系曲線Figure 6 The curve between polysaccharide concentration and superoxide anion radical clearance rate

3 結(jié)論

（1）以水為提取劑，通過單因素試驗和正交試驗，采用超聲輔助法提取了松籽殼多糖。結(jié)果表明，超聲波輔助提取松籽殼多糖的最佳工藝條件為超聲時間30min，提取溫度60℃，料液比1∶50（m∶V），超聲提取次數(shù)1次，在此條件下，多糖含量為44.26%。

（2）與常規(guī)水提法相比，超聲波提取不僅具有時間短、能耗低等優(yōu)點，同時還能夠提高多糖的含量。

（3）羥基自由基清除試驗表明松籽殼多糖與其它植物提取的多糖相同，對Fenton體系產(chǎn)生的活性羥基具有較好的清除能力，并且該清除作用隨著松籽殼多糖濃度增加而提高。超氧陰離子自由基的清除試驗表明松籽殼多糖對超氧陰離子自由基有清除作用，且該清除作用規(guī)律與羥基自由基清除試驗相同，但作用能力與對羥基自由基的清除能力相比較弱。

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