高速逆流色譜分離純化紫甘藍(lán)花色苷

易建華 潘毛頭 朱振寶

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

紫甘藍(lán)（red cabbage）又稱赤甘藍(lán)、紅甘藍(lán)，屬十字花科，是結(jié)球甘藍(lán)的一個類型，它營養(yǎng)豐富，含豐富的VC，VE。研究表明：紫甘藍(lán)花色苷具有一定的還原能力和較強的抗脂質(zhì)過氧化能力，能降低血清中的脂肪含量［1］，并對DPPH 自由基的清除有較強的效果［2，3］。目前，紫甘藍(lán)花色苷的提取及純化方法有水提取法、有機溶劑提取法、超聲波提取法、大孔樹脂法和凝膠過濾法等［4，5］，但是這些大多數(shù)是傳統(tǒng)方法，提取花色苷的量較少，純度較低，也無法用高效液相色譜法（HPLC）完全分離出來一種或多種組分。

高速逆流色譜（high－speed counter－current chromatography，HSCCC）是利用物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離的一種色譜技術(shù)。與傳統(tǒng)的液－固色譜相比，它具有高效、快速、操作簡單、回收率高、制備量大等的優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化和食品原料的開發(fā)利用等領(lǐng)域［6－10］。

本試驗以紫甘藍(lán)為原料，采用超聲波溶劑輔助法提取分離花色苷，并用高速逆流色譜法對花色苷進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，得到純度比較高的花色苷，為紫甘藍(lán)花色苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)：產(chǎn)地為陜西西安；

LSA－21大孔樹脂：西安藍(lán)曉科技有限公司；

甲醇、乙醇：分析純，市售；

乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

三氟乙酸：化學(xué)純，上海科豐化學(xué)試劑有限公司；

試驗用水：去離子水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters2487，美國Waters公司；

紫外－可見分光光度計：UV－2600型，上海尤尼柯儀器有限公司；

高速逆流色譜儀：TBE－300A，上海同田生物技術(shù)有限公司；

樹脂柱：1m×4cm，上海錦華儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波溶劑輔助法提取紫甘藍(lán)中的花色苷 采用65%乙醇超聲波輔助提取花色苷。取1kg 新鮮紫甘藍(lán)，料液比1∶5（m／V），調(diào)節(jié)pH 為2.5，超聲波功率為200 W，溫度40 ℃，提取時間為8min，過濾，合并濾液，60 ℃下減壓濃縮，得花色苷粗提液?；ㄉ沾痔嵋和ㄟ^LSA－21大孔樹脂柱吸附處理，然后分別用3BV 的蒸餾水和3BV 30%，50%，75%的乙醇依次洗脫，流速為2BV／h，收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到紫甘藍(lán)花色苷粉末1.73g，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HSCCC溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備 以正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸體積比為2∶2∶1∶5∶0.01的比例配制兩相溶劑系統(tǒng)，搖勻使其充分混合，待兩相溶液平衡后，分別置于棕色廣口瓶中，其中上相為固定相，下相為流動相。

將配好的上相和下相超聲脫氣20min，然后稱取紫甘藍(lán)花色苷粉末300mg，溶于10mL 的上相與10mL 下相溶液中，用0.45μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.2.3 HSCCC 的分離方法 進(jìn)樣前，開啟循環(huán)水浴儀，將溫度設(shè)定為25 ℃，以9mL／min的速度將固定相泵入主機，待固定相充滿螺線管后，開啟主機電源，緩慢正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至800r／min，等轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2mL／min的速度泵入流動相，待整個系統(tǒng)建立動態(tài)平衡后，將20mL 樣品溶液通過進(jìn)樣孔注入六通閥內(nèi)，開始分離，并在254nm 波長下采集數(shù)據(jù)，按照色譜峰收集流分，流分由自動接收器收集，流速設(shè)定為3mL／min，每6mL收集1管。

1.2.4 HSCCC兩相分配系數(shù)的測定 根據(jù)文獻(xiàn)［9～11］，修改如下：采用HPLC測定樣品在兩相中的分配系數(shù)。取花色苷粗提樣1～2mg，溶于2mL 上相與2mL 下相溶液中，搖勻使樣品充分溶解。待分配平衡后，分離上下相，并分別量取上相和下相各1mL，用HPLC檢測分析，按式（1）計算不同溶劑分配系數(shù)K 值：

式中：

K—— 化合物在兩相中的分配系數(shù)；

A1—— 上相中化合物的峰面積；

A2—— 下相中化合物的峰面積。

1.3 HPLC檢測分析

采用HPLC分析紫甘藍(lán)花色苷粗提物，以及經(jīng)HSCCC分離出來的各組分。色譜條件：反相C18柱（Diamonsil C18，5μm，250×4.6mm），流動相：洗脫劑（A）2%的甲酸乙腈溶液，洗 脫 劑（B）2% 的 甲 酸 水 溶 液（pH 2.57）。流 速：1.0mL／min；柱 溫：20 ℃；進(jìn) 樣 體 積：20 μL；進(jìn) 樣 濃 度：1mg／mL；檢測波長：525nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫甘藍(lán)花色苷提取物制備方法的選擇

目前，提取花色苷的方法一般是水提取法和溶劑提取法。但是水提法提取時間長、提取率低、雜質(zhì)較多，而有機溶劑提取法消耗大、費用高、且易造成環(huán)境污染，也不適用于大量制備［4－6］。本試驗采用超聲波輔助溶劑提取法提取紫甘藍(lán)花色苷，分別以乙醇濃度、提取時間、提取溫度、超聲波頻率、料液比等為影響因素，在單因素的基礎(chǔ)上，選擇提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)3種因素，各設(shè)計3個水平，通過正交試驗來優(yōu)化超聲波輔助溶劑提取的最佳工藝條件。其正交因素水平及結(jié)果分析見表1、表2。

由表2可知，超聲波輔助提取花色苷的最佳工藝條件為時間8min、溫度40℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，此時經(jīng)超聲以后的溶液其吸光度達(dá)到最大值。比較分析影響花色苷提取的3個因素，它們的影響大小順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞溫度＞時間。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Results of the orthogonal test

2.2 HSCCC溶劑系統(tǒng)的研究

在HSCCC 分離的過程中，選擇合適的溶劑系統(tǒng)是至關(guān)重要的。一般來說：合適的分配系數(shù)K 值應(yīng)在0.5～2.0，并且各組分的分配系數(shù)值要有足夠大的差異［12］。目前分配系數(shù)的測定多采用薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）、高效液相色 譜 法（HPLC）及分析型HSCCC 法［13－16］。依 據(jù) 文獻(xiàn)［17～20］，本試驗采用正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸為溶劑系統(tǒng)，并用HPLC 法測定測定其K 值。試驗依據(jù)目標(biāo)組分的K 值，對正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸這一溶劑體系的不同配比進(jìn)行了比較篩選，其各溶劑配比及K 值見表3。

表3 不同溶劑體系配比的分配系數(shù)Table 3 Distribution coefficient（K）of compounds in solvent system with different proportions

試驗考察多種溶劑體系的HSCCC分離效果。由表3可知，在以上4個溶劑系統(tǒng)中，各組分的分配系數(shù)K 值大都在0.5～2.0，基本符合分配系數(shù)要求，但是在溶劑體系1、2、4中，由于K 值比較接近，導(dǎo)致3組分不能完全分離，而溶劑體系3中的K 值相差比較大，對三目標(biāo)組分有較好的分離，綜合考慮實際分離效果和效率，最終選用溶劑體系3作為分離紫甘藍(lán)花色苷的HSCCC溶劑體系。

2.3 HSCCC分離純化的結(jié)果

按照1.2.3的方法，以正丁醇－甲基叔丁基醚－乙腈－水－三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V／V／V／V）為溶劑體系，分離出3 個組分，測得固定相保留率為56.6%。并且從300mg紫甘藍(lán)花色苷粗提樣中分離得到化合物Ⅰ（84mg），化合物Ⅱ（56mg），化合物Ⅲ（13mg）。HSCCC 分離圖譜見圖1。

由圖1可知，圖中有3個比較明顯的峰，分別在77，105，205min時出現(xiàn)，這表明紫甘藍(lán)花色苷提取樣經(jīng)HSCCC 分離得到3種化合物，分別命名為組分Ⅰ，組分Ⅱ，組分Ⅲ。

2.4 紫外可見全掃描

花色苷在紫外區(qū)和可見光區(qū)的最大吸收波長分別為275nm和523nm 左右［21］，可以通過紫外可見掃描物質(zhì)的最大波長來判定該物質(zhì)是否為花色苷類物質(zhì)。

將紫甘藍(lán)花色苷粗提樣和HSCCC 分離出來的3 個組分，分別用0.025mol／L 的氯化鉀溶液稀釋至一定濃度，用紫外可見分光光度儀進(jìn)行紫外可見全掃描，結(jié)果見圖2。

圖1 紫甘藍(lán)花色苷的HSCCC分離圖譜Figure 1 HSCCC chromatogram of anthocyanins from purple cabbage

圖2 紫甘藍(lán)花色苷粗提物及HSCCC分離組分紫外可見全掃描圖譜Figure 2 Ultraviolet visible full scan of anthocyanins and three components from purple cabbage

由圖2可知，紫甘藍(lán)花色苷粗體樣和組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在275nm 和523nm 附近都有最大吸收峰，所以可以確定3組分均為花色苷。

2.5 HPLC檢測的結(jié)果

用HPLC對紫甘藍(lán)花色苷粗提物和HSCCC 分離所得的3個組分進(jìn)行純度檢測分析，結(jié)果見圖3和圖4。根據(jù)峰面積計算出組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純度分別為76.28%，5.46%，91.46%，經(jīng)過濃縮、凍干后其質(zhì)量分別為84，56，13mg。

由圖3可知，花色苷粗提取經(jīng)過HPLC檢測得到3個比較高的峰，結(jié)合3組分的HPLC圖譜，可以確認(rèn)，它們依次為組分Ⅲ、組分Ⅱ、組分Ⅰ。

由圖4可知，3個組分經(jīng)過HPLC檢測，都等達(dá)到了良好的分離效果，特別是組分Ⅲ，幾乎沒有雜質(zhì)，純度達(dá)到了91.46%，組分Ⅰ、組分Ⅱ的純度分別為76.28%，45.46%。

圖3 紫甘藍(lán)花色苷粗提物的HPLC圖譜Figure 3 HPLC chromatogram of anthocyanins from red cabbage

圖4 紫甘藍(lán)花色苷3個組分的HPLC色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of three components

3 結(jié)論

采用超聲波溶劑輔助提取法提取紫甘藍(lán)花色苷，優(yōu)化出最佳工藝條件為提取時間8min、提取溫度40 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%。并利用HSCCC 色譜法從紫甘藍(lán)花色苷中分離得到得到3 種化合物，300 mg 紫甘藍(lán)花色苷提取物經(jīng)過HSCCC分離后得到84 mg 純度為76.28%的化合物Ⅰ、56mg 純度為45.46%的化合物Ⅱ、13mg純度為91.46%的化合物Ⅲ，但要具體確定各個分離組分的結(jié)構(gòu)，還需經(jīng)過核磁共振等試驗來鑒定。

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