HPLC測定采后蓮霧果實中可溶性糖含量及在貯藏期的變化

陳 靜 吳光斌 陳發(fā)河

（集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021）

蓮霧（Syzygium samarangense merr.et perry.）又稱洋蒲桃、甜霧、爪哇蒲桃等，為桃金娘科（myartecae）蒲桃屬植物。其果實色澤艷麗、果形獨特、風味清香，清甜多汁，且富含維生素及礦物元素，被稱為“水果皇帝”［1］。但是由于蓮霧果實含水量較高92.87%，果肉組織幼嫩，極不耐貯運［2］；且采后果實呼吸代謝旺盛，衰老速度快，若不及時處理，短時間內(nèi)果肉組織就會失水萎縮，發(fā)生絮狀綿軟現(xiàn)象，使其食用品質(zhì)急劇下降，進而腐爛變質(zhì)。蓮霧果實采后的這種果肉軟化劣變類型不同于目前已知的軟化類型，關于其采后絮狀綿軟進程的機理還鮮有報道。筆者發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，除了水分大量散失外，果肉的絮狀綿軟組織大小會增大，果肉組織中心甚至出現(xiàn)中空，這可能是由于蓮霧果實采后呼吸代謝和物質(zhì)代謝過程中造成的部分物質(zhì)虧損。

蓮霧果實中除水分外，主要物質(zhì)成分為碳水化合物，約占5.97%，且以可溶性糖為主，其余成分含量均很少［2］。關于蓮霧果實采后香氣成分、有機酸以及一些營養(yǎng)成分的研究報道比較多［3－6］，而可溶性糖成分和含量還未有報道。目前，一般化學法只用來測定總糖含量不能分別測定各種糖含量，有研究［7］表明，該法測得的葡萄糖、果糖值比實際值略高；色譜法在糖酸類化合物的分析中已有不少應用［8－10］。本試驗以臺灣蓮霧主栽品種“黑珍珠”為試驗材料，采用高效液相色譜法分析采后蓮霧果肉中可溶性糖成分及含量變化，以期為進一步從物質(zhì)代謝水平探明蓮霧果實采后果肉絮狀綿軟發(fā)生的機理及其調(diào)控因子提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮霧：黑珍珠，臺灣屏東縣泰吉果菜生產(chǎn)合作社；

果糖、葡萄糖和蔗糖標準品：中國藥品生物制品鑒定所；

乙腈：色譜純，美國天地公司；

無水乙醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

試驗用水（18 MΩ·cm）：本實驗室用Millipore Milli Q RG 超純水系統(tǒng)制備。

1.2 主要儀器

電子天平：AL104型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 1525型，美國Waters公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA 型，上海亞榮生化儀器廠；

離心機：KDC－1044型，科達創(chuàng)新股份有限公司；

恒溫恒濕箱：PSX－280H 型，寧波萊?？萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 當日到達廈門口岸的蓮霧果實，選擇成熟度基本一致，大小均勻，無機械損傷和病蟲害侵染的，置于溫度25 ℃±2 ℃和濕度80%±2%的恒溫恒濕箱中貯藏。

1.3.2 色譜條件 Carbohydrate 柱（4.0μm，4.6 mm×250mm，Waters），流動相為乙腈／水＝90／10（V／V），流速1.5mL／min，柱溫45℃，進樣量20μL，Waters 1525泵，Waters 2414示差檢測器。以保留時間定性，峰面積定量。

1.3.3 樣品的制備 參照Ding［11］和盧彩玉［12］等的方法并加以改進，具體步驟如下：蓮霧果肉冰浴研磨后稱取5.0g，樣品加入10mL 80%乙醇，35 ℃下提取30min，4 000r／min離心10min，取上清。殘渣重復提取3次，合并上清液定容至25mL，取5.0mL于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用5.0mL超純水溶解。進樣前用0.45μm 微孔濾膜過濾。

1.3.4 糖標準溶液的配制 準確稱取0.500 0g經(jīng)干燥至衡重的果糖、葡萄糖和蔗糖，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為20mg／mL 的混標母液，逐級稀釋至0.625，1.25，2.5，5，10mg／mL 的標準溶液。上機進樣前用0.45μm 微孔濾膜過濾。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇 采用Waters Carbohydrate柱以不同體積比的流動相（乙腈／水＝75／25，80／20，85／15，90／10）來測定混標液和蓮霧提取液中果糖、葡萄糖、蔗糖的分離情況和含量。結果表明，隨著乙腈比例的增加，3種糖的分離度提高，但相應的分析時間會延長。當流動相中乙腈／水＝90／10（V／V）時3種糖的分離效果較好，16min就可以完成1個樣品分析，兼顧分離度和分析時間，本試驗確定的流動相為乙腈／水＝90／10（V／V）。

2.1.2 流速的選擇 比較流動相流速在1.0，1.2，1.3，1.4，1.5mL／min條件下3種糖的分離情況。結果表明，在流速為1.5mL／min時，3種糖的出峰時間較短，峰形較好。

2.1.3 柱溫的選擇 在30，35，40，45，50 ℃條件下進行糖混標液和蓮霧提取液中可溶性糖的分析。結果表明，隨著溫度升高，3種糖的保留時間有所縮短，但分離度降低。兼顧分離度和保留時間本試驗確定色譜柱柱溫為45 ℃。

2.2 方法的線性范圍和檢出限

按1.3中的分析條件進行測定，以不同糖濃度混標峰面積y 為縱坐標，標樣濃度x（mg／mL）為橫坐標繪制標準曲線?；貧w方程及相關系數(shù)見表1。

表1 標準曲線的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍Table 1 Regression equations，correlation coefficients and linear ranges for fructose，glucose and sucrose

以信噪比S／N ＝3計算果糖、葡萄糖、蔗糖的檢出限，分別為0.12，0.21，0.03mg／mL。試驗結果表明，果糖、葡萄糖和蔗糖在0.625～20mg／mL 范圍內(nèi)，濃度與峰面積有良好的線性關系，相關系數(shù)均達到了0.999以上。

2.3 色譜圖

在1.3.2色譜條件下，得到果糖、葡萄糖和蔗糖標樣的色譜圖，其相鄰峰的分離度較好，分析時間較短，整個分析過程在16min內(nèi)完成（圖1）。

圖1 混標色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of the standard of mixed fructose，glucose and sucrose

2.4 加標回收率與精密度

采用加標法測定回收率［13］。將樣品提取液等分為4份，其中3份分別添加一定量的標準品，1份不加，同時定容至5mL。經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾后，按照1.3的色譜條件進行分析測定可溶性糖含量，計算果糖、葡萄糖蔗糖的平均回收率。試驗表明（表2），果糖、葡萄糖、蔗糖的回收率在99.05%～106.39%，說明該方法具有較高的準確度。

表2 加標回收率Table 2 Spike recoveries and relative standard deviations in a real sample（n＝3）

對同一待測提取液重復進樣6次，測定峰面積，通過計算相對標準偏差（RSD）考察此測定方法的精密度，經(jīng)測定果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD 分別為2.63%，3.98%，2.55%，結果表明該方法的精密度良好。

2.5 樣品分析

按照1.3色譜條件對樣品進行分析，測得采后蓮霧果實中的可溶性糖主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，樣品色譜圖見圖2。進一步測定采后貯藏期（25 ℃）蓮霧果實中可溶性糖含量，結果（表3）表明，采后蓮霧果實中的可溶性糖主要以單糖為主，整個貯藏期內(nèi)果糖和葡萄糖含量的變化趨勢相似，蔗糖含量一直處于減少的狀態(tài)。

圖2 蓮霧果實樣品色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of Syzygium samarangense

3 結論

通過高效液相色譜法測定蓮霧果實采后的可溶性糖組分及含量，結果表明主要為果糖、葡萄糖和蔗糖，且該方法中3種糖能得到較好的分離，保留時間重現(xiàn)性較好，加標回收率準確性高，可以作為分析檢測蓮霧果實中糖組分和含量的一種簡便、快速、準確的方法。為進一步研究蓮霧果實采后物質(zhì)代謝過程及果肉絮狀綿軟進程調(diào)控機理和貯藏保鮮技術提供理論數(shù)據(jù)。

表3 蓮霧采后可溶性糖含量Table 3 The content of soluble sugar in wax apple after harvest

采后蓮霧果實內(nèi)的具體的可溶性糖變化還需與采后的生理變化及物質(zhì)代謝相關酶進行綜合分析及多次的實驗驗證；至于蓮霧果實中物質(zhì)代謝及其對果肉絮狀綿軟的影響尚待進一步的研究。

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