miRNA指紋圖譜及其在結(jié)直腸癌個(gè)體化治療中的應(yīng)用

馬一杰，陳小兵，羅素霞

河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450008

miRNA指紋圖譜及其在結(jié)直腸癌個(gè)體化治療中的應(yīng)用

馬一杰，陳小兵，羅素霞

河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450008

目的結(jié)直腸癌為常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。由于個(gè)體差異的存在，對(duì)不同個(gè)體采用相同的治療方案不僅造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)，而且可能給患者帶來(lái)傷害。近年來(lái)，療效和個(gè)體差異的關(guān)系越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)工作者的重視，個(gè)體化治療成為臨床治療及基礎(chǔ)研究必然趨勢(shì)。分子生物學(xué)及其技術(shù)在疾病的診斷及個(gè)體化治療方面的重要性日益顯現(xiàn)。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，其表達(dá)譜的變化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有明確的相關(guān)性。因此，特定miRNA表達(dá)譜可能構(gòu)成識(shí)別結(jié)直腸癌與其他疾病的"指紋"，用于診斷、預(yù)后判斷、療效預(yù)測(cè)等領(lǐng)域，指導(dǎo)結(jié)直腸癌診斷及個(gè)體化治療。

miRNA;結(jié)直腸癌;個(gè)體化治療

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷提高，結(jié)直腸癌早期診斷和治療手段不斷創(chuàng)新。然而，臨床工作中發(fā)現(xiàn)，即使相同病理類型、分期及接受相同治療方案的不同患者，其療效及不良反應(yīng)仍具有很大的差異，這種差異有時(shí)甚至是致命的。因此，個(gè)體化治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向和必然趨勢(shì)。miRNA作為新的切入點(diǎn)，為結(jié)直腸癌個(gè)體化治療開辟了新的途徑。

1 miRNA指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展

近年來(lái)，miRNA成為研究熱點(diǎn)，其光芒蓋過(guò)siRNA、mRNA，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域閃耀的明星。它廣泛參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡等各個(gè)進(jìn)程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有趣的是，miRNA“戲路頗廣”，有時(shí)扮演正面人物-腫瘤抑制基因，有時(shí)也會(huì)飾演大反派-癌基因。對(duì)于如此極具潛力的標(biāo)志物候選者，研究者當(dāng)然不會(huì)視而不見。由于對(duì)miRNA表達(dá)譜的分析是臨床應(yīng)用的基石，其檢測(cè)技術(shù)手段在生命科學(xué)工作者的努力下也是日新月異，不斷提高創(chuàng)新。

1.1 Northern雜交 首當(dāng)其沖的，Northern雜交是一種簡(jiǎn)便可靠的檢測(cè)方法［1］。它不僅能夠用于組織細(xì)胞中 miRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，而且可以通過(guò)結(jié)合RNA marker，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)其分子大小。但是，Northern雜交的缺點(diǎn)在于可能出現(xiàn)假陰性，對(duì)樣品的需求量相對(duì)較高，有時(shí)甚至要達(dá)到40 μg的樣品量才能出現(xiàn)明顯雜交信號(hào)。

1.2 原位雜交 原位雜交是指以特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行，能夠更直觀的展示出miRNA的時(shí)空表達(dá)模式。此外，該技術(shù)不但能夠定量分析單個(gè)細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，還能夠在未經(jīng)分類及分離的情況下，比較miRNA在不同細(xì)胞株中的表達(dá)水平。

1.3 基因芯片 高通量檢驗(yàn)測(cè)定miRNA的平臺(tái)當(dāng)屬基因芯片，它能同時(shí)勘測(cè)成百上千個(gè) miRNA的表達(dá)［2］。芯片應(yīng)用大規(guī)模微陣列技術(shù)，將數(shù)千探針整合于一張芯片，篩選速度和通量得到了很大提高，成為廣大研究者的首選方案。該技術(shù)在眾多研究中被采用，藉此建立了不同物種組織miRNA表達(dá)譜，同時(shí)也被廣泛應(yīng)用于病變組織和正常組織miRNA表達(dá)譜差異鑒定。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)RT-PCR是一種半定量或定量檢測(cè)miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在miRNA表達(dá)的研究過(guò)程中得到不斷改進(jìn)。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于:可在短時(shí)間內(nèi)高通量檢測(cè)多種miRNA表達(dá);較之 Northern雜交不需要放射性同位素標(biāo)記，且RNA需求量較小;能夠同時(shí)對(duì)成熟miRNA及前體miRNA進(jìn)行檢測(cè);操作簡(jiǎn)便。

2 miRNA指紋圖譜與結(jié)直腸癌個(gè)體化治療

2.1 miRNA指紋圖譜在結(jié)直腸癌靶向治療中的應(yīng)用

miRNA通過(guò)參與調(diào)控一些細(xì)胞生命活動(dòng)關(guān)鍵信號(hào)通路相關(guān)蛋白，如 Wnt/β 粘連蛋白［3］及 PI3K 通路［4］、KRAS［5-6］、p53［7-8］、IGF 信號(hào)通路［9］、E2F 家族［10］、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控因子以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)轉(zhuǎn)錄因子等［11-12］，組成強(qiáng)大的基因網(wǎng)絡(luò)，它們極有潛力成為結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)和強(qiáng)大的干預(yù)工具。

相關(guān)研究顯示，抑制miR-21和miR-17-92活性能夠減少腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移［13-14］。這些miRNA在結(jié)直腸癌中充當(dāng)癌基因或抑癌基因，且可能成為miRNA靶向治療候選分子。靶向這些miRNA不僅能夠阻止UICCⅡ期高危疾病的復(fù)發(fā)，還可以控制進(jìn)展期轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長(zhǎng)。調(diào)控抑癌或促癌基因的基因治療可以用來(lái)治療結(jié)直腸癌并阻斷損害的進(jìn)展。這種調(diào)控能控制腫瘤生長(zhǎng)率且極有潛力成為早期或進(jìn)展期腫瘤嶄新的治療手段［15-16］。但是，它們也可能誘導(dǎo)放化療耐藥的發(fā)生。盡管試驗(yàn)性miRNA治療看起來(lái)很有前景，但是只有數(shù)量有限的研究進(jìn)行了動(dòng)物模型的體內(nèi)試驗(yàn)。未來(lái)第一個(gè)臨床miRNA靶向療法的開發(fā)任重而道遠(yuǎn)。

2.2 miRNA指紋圖譜技術(shù)在結(jié)直腸癌化療中的應(yīng)用

個(gè)體化治療的另一個(gè)關(guān)鍵部分在于化療療效預(yù)測(cè)。Nakajima等［17］對(duì)接受S-1(基于5-FU的抗代謝藥物)治療的結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中5種成熟miRNA進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)let-7g和miR-181b可作為S-1為基礎(chǔ)的化療應(yīng)答預(yù)測(cè)因子。Borralho等［18］以結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為模型，探討miR-143對(duì)在化療敏感性方面的生物學(xué)作用。研究顯示，一過(guò)性miR-143過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致約60%的細(xì)胞減少。此外，該研究小組用G418篩選穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-143的細(xì)胞并用5-FU進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-143的細(xì)胞經(jīng)5-FU處理后活性下降且凋亡增加，且這些變化均伴隨核碎裂的增加和 caspase-3，-8，-9 激活。Boni等［19］在61 例接受5-FU和伊立替康(CPT-11)治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，對(duì)18種miRNA基因所在區(qū)域 (原始miRNA和miRNA前體)及miRNA合成相關(guān)基因的多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，pri-miR-26a-1 SNP rs7372209與腫瘤應(yīng)答和疾病進(jìn)展時(shí)間 (TTP)相關(guān)(P值分別為0.041和 0.017)?；蛐虲C、CT較TT相比具有更好的預(yù)后。SNP rs1834306，位于pri-miR-100基因上，顯示出較長(zhǎng)的TTP(P=0.04)。在miRNA的生物合成途徑方面，輸出蛋白-5基因 SNP rs11077與疾病控制率之間具有相關(guān)趨勢(shì)(P=0.076)。

2.3 miRNA指紋圖譜在結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估中應(yīng)用

既有證據(jù)顯示miRNA表達(dá)模式對(duì)已確診的腫瘤是獨(dú)一無(wú)二的，且極具潛力成為臨床預(yù)后因子。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織miR-148a和miR-152表達(dá)水平與配對(duì)癌旁組織相比顯著降低(P＜0.001)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-152、miR-148a的表達(dá)水平與腫瘤大小(P值分別為0.004和0.018)及病理T分期 (P值分別為0.002和0.023)負(fù)相關(guān)。

MiR-21在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的很多實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，且其過(guò)表達(dá)與已知預(yù)后因子如N分期，疾病轉(zhuǎn)移和UICC 分期等密切相關(guān)［21］。Kulda 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-143表達(dá)水平與無(wú)病生存期(DFI)相關(guān)(P值分別為0.0026和0.0191)。MiR-21高表達(dá)的患者DFI較短。令人驚訝的是，腫瘤抑制基因miR-143高表達(dá)者也表現(xiàn)出較短的DFI。通過(guò)對(duì)比分析，Schetter等［23］發(fā)現(xiàn)37種不同miRNA在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中異常表達(dá)。其中，miR-20a，miR-21，miR-106a，miR-181b，和miR-203在COX回歸分析中顯示出較差的生存。該研究組在驗(yàn)證試驗(yàn)中用RT-PCR法檢測(cè)腫瘤及配對(duì)非腫瘤組織中miRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，只有miR-21過(guò)表達(dá)與較差的預(yù)后顯著相關(guān)，而與年齡、性別和腫瘤位置無(wú)關(guān)。多元分析進(jìn)一步顯示腫瘤中miR-21高表達(dá)與較差的生存有關(guān)，且獨(dú)立于腫瘤分期之外。Schepeler等［24］發(fā)現(xiàn)miRNA和Ⅱ期結(jié)腸癌微衛(wèi)星穩(wěn)定性有關(guān)，基于miRNA表達(dá)譜的標(biāo)記物預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的總體準(zhǔn)確度高達(dá)81%，因此，miRNA在判斷腫瘤侵襲能力方面極具應(yīng)用潛力。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達(dá)miR-320或miR-498的Ⅱ期結(jié)直腸癌患者無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)與低表達(dá)患者相比顯著縮短。這些miRNA與PFS的關(guān)系也在多元分析中得到驗(yàn)證。

3 展望

檢測(cè)技術(shù)日新月異的同時(shí)，仍然存在一定的局限性。因此，我們需要綜合運(yùn)用現(xiàn)有技術(shù)手段的同時(shí)加快miRNA表達(dá)譜研究技術(shù)的開發(fā)和改進(jìn)，進(jìn)一步提高其敏感性、特異性、穩(wěn)定性以及可重復(fù)性。

miRNA指紋圖譜為結(jié)直腸癌臨床個(gè)體化治療提供新思路，如何結(jié)合臨床需求利用miRNA指紋圖譜技術(shù)指導(dǎo)臨床決策具有探索性。相信在不久的將來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究的深入和試驗(yàn)技術(shù)的完善，miRNA必將在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究和個(gè)體化治療中發(fā)揮更大的作用，帶來(lái)未來(lái)臨床醫(yī)學(xué)上的變革。

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MicroRNA fingerprint in colorectal cancer and its application in individual therapy

MA Yijie，CHEN Xiaobing，LUO Suxia
Department of Oncology，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China

Colorectal cancer is one of the most frequent malignant disease，it is still a very severe disease for people.Due to individual differences，the same treatment plan for different people would waste medical resources and even harm patients.The efficacy of the oncological treatment depends mainly on the features of the malignant tissue.During the last decade，the importance of the molecular biology and it’s methodology have been growing for both detection of the disease and the selection of the best treatment plan for individual patient.MicroRNAs(miRNAs)are short non-coding segments of RNA which are involved in colorectal cancer development.Thus，“fingerprint”consisted of miRNA expression patterns may contribute individual therapy by refine diagnosis，prognosis and therapeutic effect prediction.

miRNA;Colorectal cancer;Individual therapy

R735.3+4

A

1006－5709(2012)11－0994－03

2012-05-04

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.004

馬一杰，碩士。E-mail:mayijie1987@126.com

陳小兵，E-mail:chenxiaobing@medmail.com.cn;羅素霞，E-mail:luosxrm@163.com

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