miR－183在人乳腺癌中表達(dá)及意義*

吳正升， 吳 強(qiáng)

(安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，安徽合肥230032)

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是其難以根治和患者死亡的主要原因。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的和多步驟的過程，很多因子參與了這一過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)也參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，它們通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等很多過程中發(fā)揮了重要作用［1－3］。本課題組前期通過miRNA芯片檢測了不同侵襲活性的人乳腺上皮細(xì)胞株的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)很多miRNA出現(xiàn)了顯著的差異性表達(dá)，可能與乳腺細(xì)胞侵襲活性有一定的關(guān)系［4－5］。在這些差異性表達(dá)的miRNA中包括了miR－183，其表達(dá)在高侵襲乳腺癌細(xì)胞MDA－MB－231和MDA－MB－468中較低侵襲細(xì)胞MCF－7和HBL－100顯著下調(diào)。在本研究中，我們將首先使用實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證前期芯片中miR－183的表達(dá)結(jié)果，同時(shí)進(jìn)一步檢測臨床人乳腺癌和良性病變組織中miR－183表達(dá)。然后，我們將在體外以乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞為模型，使用miRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析miR－183對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移活性的影響，試圖為認(rèn)識乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提高新的理論線索。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株和病人材料 人乳腺上皮細(xì)胞系HBL－100，人乳腺癌細(xì)胞系MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468均購自美國典藏細(xì)胞庫(ATCC);收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年7月～2010年6月間乳腺病例29例，其中乳腺癌18例，乳腺良性病變(纖維腺瘤和/或腺病)11例，患者均為女性，所有患者術(shù)前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。所有新鮮組織切除后快速置于液氮速凍后儲存于－70℃，直到RNA的抽提。

1.2 主要試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基購自Corning;胎牛血清購自Hy-Clone;miRNA提取試劑盒和miR－183模擬物(mimic)、熒光定量PCR檢測試劑盒均購自Ambion;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen;miR－183模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor，即反義寡核苷酸，antisense oligonucleotide，ASO)和陰性對照(negative control，NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Promega;侵襲小室購自Corning;基質(zhì)膠購自BD。

2 方法

2.1 檢測細(xì)胞株和新鮮組織中miR－183的表達(dá)HBL－100細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI－1640培養(yǎng)基中，MDA－MB－231和MDA－MB－468細(xì)胞培養(yǎng)于L15培養(yǎng)基中，均添加10%胎牛血清。10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿隔天傳代擴(kuò)增HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好，近90%融合時(shí)，以預(yù)冷PBS沖洗3次終止培養(yǎng)，冰上用刮棒刮取細(xì)胞，移入離心管，4℃、8 000 r/min離心10 min，去上清，收集細(xì)胞，備用;取乳腺新鮮組織100 mg，置于液氮預(yù)冷處理的研缽中，固化、研碎，備用。按照miRNA提取試劑盒說明，分別抽提4株細(xì)胞系和乳腺新鮮組織中總miRNA。按照Ambion公司的mirVanaTMqRT－PCR miRNA檢測試劑盒說明，首先對各個(gè)細(xì)胞系和新鮮組織總miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用U6作為內(nèi)參照。

2.2 miR－183 ASO和mimic的轉(zhuǎn)染 選擇乳腺癌細(xì)胞MCF－7和MDA－MB－231為模型，細(xì)胞接種后24 h，待貼壁細(xì)胞達(dá)到30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染miR－183 ASO、miR－183 mimic和NC。

2.3 細(xì)胞增殖活性的檢測 取轉(zhuǎn)染36 h后miR－183 ASO組和NC組MCF－7細(xì)胞，以及miR－183 mimic組和NC組的MDA－MB－231細(xì)胞，按照MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明，分別于接種96孔板后24、48、72和96 h各檢測1次。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞侵襲和遷移活性的檢測 取轉(zhuǎn)染48 h后miR－183 ASO組和NC組MCF－7細(xì)胞，以及miR－183 mimic組和NC組的MDA－MB－231細(xì)胞，在Transwell小室接種細(xì)胞前1 d，在小室底部膜的上室面鋪基質(zhì)膠(遷移實(shí)驗(yàn)不加基質(zhì)膠)，按照Transwell小室說明，將侵襲小室下室加入含10%FBS RPMI－1640培養(yǎng)基，將侵襲小室上室加入各組細(xì)胞懸液。將侵襲小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，倒置顯微鏡下觀察侵襲小室下室，待少量細(xì)胞穿出后終止實(shí)驗(yàn)。用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.25%考馬斯亮藍(lán)染色。正置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，采用5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。臨床乳腺病變組織中miR－183的表達(dá)用中位數(shù)(median)、四分位數(shù)間距(interquartile range)和極差(range)表示，組間比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn);其余數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 miR－183在乳腺上皮細(xì)胞系和臨床乳腺病變組織中表達(dá)

本課題組前期使用miRNA芯片檢測了人乳腺細(xì)胞系 HBL－100、MCF－7、MDA－MB－231和MDA－MB－468的miRNA表達(dá)譜［4－5］，其中高侵襲細(xì)胞系MDA－MB－231和MDA－MB－468中miR－183表達(dá)均較低侵襲HBL－100和MCF－7細(xì)胞顯著下調(diào)，見圖1。本研究進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測了這4株細(xì)胞miR－183表達(dá)，其結(jié)果與芯片結(jié)果一致，即MDA－MB－231和MDA－MB－468細(xì)胞中miR－183表達(dá)較HBL－100和MCF－7細(xì)胞顯著下調(diào)(P＜0.01)，見圖1。18例人新鮮乳腺癌組織miR－183表達(dá)也較11例乳腺良性病變組織顯著下調(diào)(P＜0.01)，見圖2。

Figure 1.Expression of miR－183 in human breast cell lines detected by miRNA microarray and real－time PCR s.n=3.＊＊P＜0.01 vs HBL－100 or MCF－7.圖1 miR－183在人乳腺上皮細(xì)胞株中表達(dá)

Figure 2.Expression of miR－183 in human breast disease tissue specimens.The data were presented as box plot (bold horizontal lines within the boxes represent the medians;lower and upper borderlines of the boxes represent the 1st and 3rd quartiles，respectively;lower and upper whiskers represent the minimum and maximum，respectively).＊＊P＜0.01 vs benign breast disease.圖2 miR－183在臨床人乳腺病變組織中表達(dá)

2 miR－183對乳腺癌細(xì)胞MCF－7和MDAMB－231增殖活性的影響

miR－183 ASO組與NC組相比，miR－183 mimic組與NC組相比，各個(gè)時(shí)點(diǎn)細(xì)胞的增殖數(shù)目差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

3 miR－183對乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移活性的影響

如圖3所示，通過轉(zhuǎn)染miR－183 ASO下調(diào)MCF－7細(xì)胞內(nèi)源性miR－183表達(dá)，能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力(未加入基質(zhì)膠的遷移實(shí)驗(yàn))，即細(xì)胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著提高(均P＜0.01);如圖4所示，通過轉(zhuǎn)染miR－183 mimic上調(diào)MDAMB－231細(xì)胞內(nèi)源性miR－183表達(dá)，能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的侵襲能力，以及遷移至小室膜的能力，即細(xì)胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著降低(均P＜0.01)。

討論

Figure 3.Migration and invasion assay on MCF－7 cells transfected with miR－183 ASO and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.圖3 MCF－7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－183抑制物和陰性對照后的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

Figure 4.Migration and invasion assay on MDA－MB－231 cells transfected with miR－183 mimic and negative control.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs negative control.圖4 MDA－MB－231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－183模擬物和陰性對照后的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

miRNAs不僅在調(diào)控生物體各種生理活動(dòng)和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有著密切關(guān)系［2－3，6－7］。miRNA在乳腺癌方面的研究也是研究熱點(diǎn)之一。Valastyan等［8］使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了miR－31可以通過調(diào)控RhoA等3個(gè)靶基因表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Gregory等［9］發(fā)現(xiàn)miR－200家族成員通過作用于ZEB1和SIP1調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)過程，二者是E－cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子。Sempere等［10］用原位雜交的方法檢測了乳腺組織中miR－205的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR－205只在正常肌上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在乳腺惡性病變區(qū)的肌上皮細(xì)胞中表達(dá)量下調(diào)甚至完全消失，說明miR－205表達(dá)量的減少可能與乳腺腫瘤的惡性演進(jìn)有關(guān)。Foekens等［11］利用miRNA表達(dá)譜分析研究了38例雌激素受體陽性無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌樣本，發(fā)現(xiàn)4種miRNAs(miR－7、miR－128a、miR－210和miR－516－3p)與乳腺癌的演進(jìn)有關(guān)。Ma等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR－10b在乳腺癌細(xì)胞中顯著上調(diào)，外源性導(dǎo)入miR－10b可以使無侵襲力的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咔忠u力細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR－10b是通過參與Twist基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮作用的。這些研究結(jié)果顯示miRNA可能參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程。

本研究前期通過miRNA芯片技術(shù)檢測不同侵襲特性的人乳腺細(xì)胞株［4－5］，試圖篩選出可能參與乳腺癌侵襲過程的miRNA。miR－183的miRNA芯片結(jié)果顯示，高侵襲性的MDA－MB－231和MDAMB－468中miR－183表達(dá)較低侵襲HBL－100和MCF－7細(xì)胞顯著下調(diào)。為此，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了miRNA芯片中miR－183表達(dá)數(shù)據(jù)，兩者結(jié)果一致，提示了miRNA芯片結(jié)果的可靠性。我們在臨床乳腺新鮮病變組織中再次檢測了miR－183的表達(dá)，結(jié)果顯示乳腺癌組織中miR－183出現(xiàn)了顯著下調(diào)。這些細(xì)胞株和臨床組織的結(jié)果提示miR－183的失調(diào)可能參與了乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的過程。但miR－183具體的功能是什么，對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為有何影響，目前尚不明了。為闡明這些問題，我們使用化學(xué)合成的miR－183抑制物轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，人為下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性miR－183表達(dá)，然后觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、侵襲和遷移活性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性下調(diào)miR－183對細(xì)胞增殖影響不明顯，但可以顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Wang等［13］同樣使用miRNA芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR－183在高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95C中表達(dá)顯著下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)miR－183通過調(diào)控其靶基因 Ezrin表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。Lowery等［14］通過轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞 miR－183前體(premiR－183)來過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)源性miR－183水平，功能實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR－183能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移，結(jié)果與我們一致，提示miR－183在乳腺癌中可能扮演了抑癌基因角色，參與了乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移過程。

綜上所述，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，證實(shí)了miR－183失調(diào)是乳腺癌發(fā)病的一個(gè)現(xiàn)象，并且miR－183具有抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的功能，提示miR－183可能參與了乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。

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