持續(xù)性心房顫動(dòng)患者2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道基因和蛋白表達(dá)的變化

徐先增 黃 凱 曾知恒 伍偉鋒 劉唐威

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 南寧 530021

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見的一種心律失常，發(fā)病后可致病死率明顯增加［1］。房顫發(fā)生后可使離子通道重構(gòu)，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，頻率適應(yīng)性下降，易于房顫維持，即“電重構(gòu)”［2－3］。2型小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（type 2small－conductance calcium－activated potassium channel，SK2）是鈣激活鉀通道的一種亞型，人心肌細(xì)胞上有表達(dá)，參與心肌細(xì)胞的復(fù)極過程，心房表達(dá)多于心室［4］，已有研究證實(shí)SK2表達(dá)量的變化與房顫有關(guān)［5－6］。但目前對(duì)于SK2和房顫關(guān)系的研究多限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，本研究以持續(xù)性房顫患者為研究對(duì)象，目的在于探究人患持續(xù)性房顫后SK2的變化在電重構(gòu)中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院心胸外科住院的風(fēng)濕性心臟病行二尖瓣置換成形術(shù)的患者，持續(xù)性房顫23例（房顫組），其中3例既往合并腦栓塞，竇性心律18例（竇律組），取體外循環(huán)插管前的新鮮右心耳組織，分兩份分別用于逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)聚合反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，PTPCR）和免疫組化。取材前患者簽署知情同意書，且獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 RT－PCR （1）總RNA提取：按1mL Trizol（Invitrogen公司）／100mg心耳組織，分步提取總RNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄：取1μg總RNA參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）說明書將其中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。（3）引物設(shè)計(jì)：用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。目的基因KCNN2（SK2的編碼基因，NCBI編號(hào)NM＿021614.2）上游5＇－GGACTGTCCGAGCTTGTG－3＇，下游5＇－TGATGTTCTGGGTCTTTGC－3＇，擴(kuò)增片段486bp；內(nèi)參基因GAPDH（NCBI編號(hào)NM＿002046.3）上游5＇－AGAAGGCTGGGGCTCATTTG－3＇，5＇－AGGGGCCATCCACAGTCTTC－3＇，擴(kuò)增片段258bp。（4）PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系（25μL）包括cDNA 1μL，目的基因上下游引物各0.5μL，內(nèi)參基因上下游引物各0.5 μL，2×PCR Mix（北京天根公司）12.5μL，去離子水9.5μL；反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min（94℃30s，62℃30s，72℃30s）×35個(gè)循環(huán)，72℃10min。（5）電泳及圖像掃描：2%瓊脂糖凝膠100V穩(wěn)壓電泳，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad公司）成像，Quantity one軟件分析PCR電泳結(jié)果，測(cè)量同泳道目的和內(nèi)參兩條帶的Trace Qty值，用其比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組化 心耳標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，制作蠟塊，切片，SP法染色。一抗：兔抗人KCNN2（Abcam公司，編號(hào)ab83733）1：1000，二抗：羊抗兔（碧云天公司）1：5000。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)不加一抗，其余步驟相同。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×400），應(yīng)用圖像分析軟件（imagepro plus，IPP）測(cè)定每個(gè)視野陽性信號(hào)的累積光密度（integrate optical density，IOD），并取均值。IOD值越大，表明組織中SK2蛋白表達(dá)量越多。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所測(cè)得數(shù)據(jù)用±s表示。正態(tài)資料用t檢驗(yàn)，偏態(tài)資料用秩和檢驗(yàn)，兩樣本構(gòu)成比用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 與竇律組比較，房顫組患者二尖瓣狹窄病變更多，左房?jī)?nèi)徑和心胸比率更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），其他相關(guān)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 2組患者基線資料比較

2.2 RT－PCR 同一心房組織同時(shí)擴(kuò)增目的基因KCNN2和內(nèi)參基因GAPDH的特異性引物，瓊脂糖凝膠電泳顯示相互之間無明顯干擾，為兩條分離的條帶。見圖1。條帶分子量與待擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度一致，分別為486bp和258bp。2組內(nèi)參基因GAPDH基因表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但房顫組較竇律組KCNN2表達(dá)顯著降低（P＜0.05），與內(nèi)參基因的比值亦顯著降低（P＜0.05），下調(diào)幅度44%，提示房顫組患者心房組織的KCNN2mRNA水平明顯降低。見表2。

圖1 PT－PRC測(cè)定右心房KCNN2的基因表達(dá) 1～4來自4例竇律患者，5～7來自3例房顫患者

表2 2組患者心房組織KCNN2的基因表達(dá) （±s）

表2 2組患者心房組織KCNN2的基因表達(dá) （±s）

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2.3 免疫組化 與竇律組比較，房顫組心房肌細(xì)胞增大明顯。SK2蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色，在胞膜和胞漿均有分布，胞核內(nèi)則無明顯分布。胞膜陽性表達(dá)呈相對(duì)淡染的環(huán)狀；胞漿陽性表達(dá)主要在核周。心耳各層心肌細(xì)胞組織表達(dá)相對(duì)均勻，無明顯灶性或區(qū)域性表達(dá)。房顫組與竇律組比較SK2蛋白表達(dá)減少，IOD分別為2 525 900±772 807.4和2 206 917±1 170 312，下調(diào)幅度13%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但細(xì)胞內(nèi)分布特點(diǎn)變化不明顯。見圖2。

圖2 免疫組化測(cè)定右心房SK2的蛋白表達(dá)（×400）A竇律患者的陽性表達(dá)，B房顫患者的陽性表達(dá)，C竇律患者的陰性對(duì)照，D房顫患者的陰性對(duì)照

3 討論

心房顫動(dòng)是臨床上常見的心律失常，各種類型心臟病均可導(dǎo)致心房顫動(dòng)。一旦發(fā)生心房顫動(dòng)，可使心房有效不應(yīng)期縮短，降低頻率適應(yīng)性，即所謂“電重構(gòu)現(xiàn)象”，使得心房顫動(dòng)更加易于發(fā)生和維持。離子通道的重構(gòu)是導(dǎo)致電重構(gòu)的基礎(chǔ)，探究各種離子通道的重構(gòu)對(duì)于研究心房顫動(dòng)的發(fā)生和維持機(jī)制以及尋找可能的治療靶點(diǎn)都有重要意義。目前治療心房顫動(dòng)的抗心律失常藥物往往導(dǎo)致嚴(yán)重的致惡性室性心律失常，原因是其作用的離子通道靶點(diǎn)房室間分布不具有選擇性，而為了盡量避免可能的致惡性室性心律失常作用，尋找僅作用于心房分布特異性離子通道靶點(diǎn)如I（Kur）的抗心律失常藥物成為研究的熱點(diǎn)［7］。鈣激活鉀通道分布非常廣泛，被細(xì)胞內(nèi)微量鈣離子（＜1.0μM）激活，按電導(dǎo)大小可分為大電導(dǎo)（BK）、中電導(dǎo)（MK）和小電導(dǎo)（SK）三種類型，SK2則屬于SK的一種亞型，α亞基是通道的功能亞基，為KCNN2基因所編碼，可被極低濃度（100pM～10nM）的蜂毒明肽特異性阻斷［8］。研究證明心房的SK2表達(dá)明顯多于心室［4］，短時(shí)間快速刺激肺靜脈即可見SK2表達(dá)增加，蛋白膜向轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，全細(xì)胞水平電流密度加大，且這些變化與動(dòng)作電位的縮短關(guān)系明顯，因此被認(rèn)為是治療心房顫動(dòng)的另一個(gè)可能的理想靶點(diǎn)［9］。而近期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確實(shí)也證明，應(yīng)用SK2阻斷劑能夠預(yù)防和終止心房顫動(dòng)的發(fā)作［10］。但以上研究均為模擬短期心房顫動(dòng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，人患持續(xù)性心房顫動(dòng)后SK2的結(jié)構(gòu)和功能的改變并不為人知曉。

本研究則探討人患持續(xù)性心房顫動(dòng)后SK2基因和蛋白的變化，為能使2組更具可比性，我們選擇的對(duì)象均為風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病變病例，但房顫組中二尖瓣狹窄比例更大，而竇律組二尖瓣關(guān)閉不全比例更大。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，房顫患者的左房?jī)?nèi)徑以及心胸比例更大，提示心功能不全與房顫存在互為因果的關(guān)系。通過RT－PCR發(fā)現(xiàn)，房顫組SK2基因表達(dá)下降明顯，而通過免疫組化發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)也有小幅下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果與初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示該通道表達(dá)上調(diào)的結(jié)果不相符，原因有以下幾種可能：（1）長(zhǎng)期持續(xù)性的房顫通過某些機(jī)制，使SK2基因蛋白早期上調(diào)，但晚期出現(xiàn)再次下調(diào)，這一推斷需要來自陣發(fā)性房顫患者實(shí)驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步證實(shí)；（2）人患房顫后SK2基因蛋白的表達(dá)本就下調(diào)，畢竟動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全適用于臨床患者。本研究未從全細(xì)胞或單通道水平測(cè)定離子通道功能的變化，但一些學(xué)者認(rèn)為離子通道功能的改變很大程度上取決于通道基因表達(dá)的改變［11］。因?yàn)槿嘶汲掷m(xù)性房顫后SK2基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，用于防治動(dòng)物陣發(fā)性房顫有效的SK2特異性阻斷劑用于持續(xù)性房顫患者可能無效或有害。但也應(yīng)看到，細(xì)胞內(nèi)鈣負(fù)荷增加導(dǎo)致的L型鈣電流密度下降是心房顫動(dòng)發(fā)生后電重構(gòu)中最重要的改變［12－13］，而一些鉀電流如I電流密度下降可能僅為次要作用［14］，其綜合改變的結(jié)果仍然是有效不應(yīng)期縮短，而此時(shí)應(yīng)用I的阻斷劑仍可改善電重構(gòu)，預(yù)防或終止房顫的發(fā)生［7］。另外，SK2功能水平主要受細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度影響，房顫發(fā)生后細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，因此即使SK2基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，其功能水平仍然因?yàn)镃a2＋濃度增加而上調(diào)，此時(shí)應(yīng)用SK2特異性阻斷劑后，仍然有益于預(yù)防或終止房顫的發(fā)生，當(dāng)然這些推測(cè)需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此即使SK2基因蛋白表達(dá)下調(diào)，同樣也可能不會(huì)影響SK2特異性阻斷劑預(yù)防和治療房顫患者，但最終結(jié)果仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，與初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，人患持續(xù)性房顫后SK2基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，用于防治動(dòng)物陣發(fā)性房顫有效的SK2特異性阻斷劑是否適用于持續(xù)性房顫患者仍然有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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