外源激素對(duì)紫穗狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

張曉瑩，張瀚儷，牟 彤，龔束芳

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.國家廣電總局2024臺(tái)，黑龍江 佳木斯 154007)

由于獨(dú)特的形態(tài)和生態(tài)特點(diǎn)，觀賞草在豐富園林植物景觀中的作用越來越受到人們的重視[1-3]。紫穗狼尾草(Pennisetumalopecuroides)花序獨(dú)特、株型柔美、生性強(qiáng)健、適應(yīng)性強(qiáng)，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊[4-5]。哈爾濱地區(qū)園林植物景觀中類似于紫穗狼尾草這種抗逆性強(qiáng)、低養(yǎng)護(hù)成本的植物資源匱乏，引種栽培紫穗狼尾草可以豐富該地區(qū)園林植物資源、創(chuàng)造獨(dú)特的園林植物景觀。引種結(jié)果表明[5]，紫穗狼尾草能夠露地越冬，為確保其快速繁殖及推廣應(yīng)用，進(jìn)而對(duì)紫穗狼尾草的植株再生進(jìn)行相關(guān)研究，明確外源激素對(duì)其植株再生的影響是十分必要的。本試驗(yàn)對(duì)紫穗狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)及分化的激素種類及濃度配比進(jìn)行篩選，旨為建立紫穗狼尾草的植株再生體系提供依據(jù)，也為今后導(dǎo)入抗寒等目的基因、體細(xì)胞無性系變異的篩選等抗性育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 紫穗狼尾草由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林系實(shí)驗(yàn)中心提供，于2008年4月從“北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心”引種栽培。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無菌外植體培養(yǎng) 選取成熟飽滿的紫穗狼尾草種子，剝?nèi)シN子外包片，蒸餾水洗凈。在超凈工作臺(tái)中用75%的酒精浸泡40 s，無菌水沖洗3～4次，再用3%次氯酸鈉對(duì)外植體分別消毒5.0 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干后接種于MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)一周后，選擇無污染的種子為試驗(yàn)材料，待無菌種子萌發(fā)后，以帶種子的幼芽為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo) 2,4-D對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的生長素2,4-D(0，1.0，2.0，3.0,4.0,5.0，6.0 mg·L-1)，每個(gè)處理接種50個(gè)外植體，進(jìn)行暗培養(yǎng)。每7 d觀察一次，15 d繼代培養(yǎng)一次，第30天統(tǒng)計(jì)出愈個(gè)數(shù)，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

2,4-D、NAA、KT激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素2,4-D、NAA、KT(表1)，采用3因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)。每個(gè)處理接種50個(gè)外植體，進(jìn)行暗培養(yǎng)。每7 d觀察一次，15 d繼代培養(yǎng)一次，第30天統(tǒng)計(jì)出愈個(gè)數(shù)，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 2,4-D、NAA、KT因素水平

2,4-D、KT、6-BA激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響：將外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D、KT、6-BA(表2)，采用3因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)。每個(gè)處理接種50個(gè)，進(jìn)行暗培養(yǎng)。每7 d觀察一次，第30天統(tǒng)計(jì)出愈個(gè)數(shù)，并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

表2 2,4-D、KT、6-BA因素水平

1.2.3愈傷組織的分化 選用長勢良好的狼尾草愈傷組織為試驗(yàn)材料進(jìn)行愈傷組織的分化研究。根據(jù)控制根或芽分化的激素模式——生長素/細(xì)胞分裂素模型，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA、6-BA、KT(表3)，采用3因素3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)。每個(gè)處理各接種30個(gè)愈傷組織，置于光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為(25±1) ℃。每7 d觀察一次，每15 d繼代培養(yǎng)一次，第30天統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

表3 NAA、6-BA、KT因素水平

采用Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用極差分析法和方差分析法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織分化率等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，k、R參數(shù)分別表示均值和極差[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 將外植體接種到各誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖1-Ⅰ)，7 d左右周圍出現(xiàn)少量白色半透明的愈傷組織(圖1-Ⅱ)，15 d左右愈傷組織膨大(圖1-Ⅲ)，生長較快。為保證愈傷組織旺盛的生活力，誘導(dǎo)出的愈傷組織每15 d繼代一次，第30天統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)并計(jì)算誘導(dǎo)率。

2.1.1不同濃度2,4-D對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 未添加2,4-D的MS培養(yǎng)基(B1)中，幼芽周圍沒有愈傷組織形成，均干枯死亡(表4)。添加2,4-D的MS培養(yǎng)基，均可誘導(dǎo)出愈傷組織，說明2,4-D對(duì)愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用。但是不同濃度的2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)能力存在明顯差異。2,4-D質(zhì)量濃度為1.0～3.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率逐漸提高，為3.0～4.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率逐漸下降。由此可見，在一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高2,4-D的濃度有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，濃度過高則起到抑制作用。

2.1.2NAA、2,4-D和KT激素組合對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 愈傷組織誘導(dǎo)率效果最好的激素組合為C5培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為84%(表5)。而當(dāng)激素配比為C9培養(yǎng)基時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為24%。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，各因素的極差由大至小順序?yàn)镽A(46.667)>RB(8.667)>RC(8.000)，說明各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的作用大小為2,4-D>NAA>KT。NAA與KT的作用相近，且均以較低濃。度為宜，其濃度保持在0.5～1.0 mg·L-1對(duì)于因素A，k2(78.667)>k1(53.333)>k3(32.000)，說明不同質(zhì)量濃度的2,4-D對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?.0>1.0>5.0 mg·L-1。對(duì)于因素B，k2(60.000)>k3(52.667)>k1(51.333)，說明不同濃度的NAA對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?.0>2.0>0.5 mg·L-1。對(duì)于因素C，k3(59.333)>k2(53.333)>k1(51.333)，說明不同質(zhì)量濃度KT對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?.0>0.5>0.1 mg·L-1。

圖1 狼尾草誘導(dǎo)愈傷組織的過程

表4 不同質(zhì)量濃度2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

比較各因素的k值，最大的k值分別是因素A的k2(78.667)，因素B的k2(60.000)，因素C的k3(59.333)，因此理論上9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中最佳試驗(yàn)組合為MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中外源激素的種類及濃度配比與C5培養(yǎng)基相同。

2.1.3KT、2,4-D和6-BA激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響 愈傷組織誘導(dǎo)率最高為74%，其激素組合為D6培養(yǎng)基，D7培養(yǎng)基時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為24%(表6)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素的極差，由大至小順序?yàn)镽A(33.333)>RB(14.000)>RC(2.667)，說明各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的作用大小為2,4-D>KT>6-BA。

綜上可知，2,4-D對(duì)紫穗狼尾草愈傷組織的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，NAA和KT的誘導(dǎo)作用相對(duì)較弱，6-BA的作用最弱。因此，最適合紫穗狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+2,4-D 3.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。

2.2植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)狼尾草愈傷組織分化的影響

2.2.1NAA與6-BA組合對(duì)狼尾草愈傷組織分化的影響 將紫穗狼尾草的愈傷組織轉(zhuǎn)接到各分化培養(yǎng)基，15 d后愈傷組織表面開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)(圖2-Ⅰ)，30 d左右分化出不定芽(圖2-Ⅱ)。

不同質(zhì)量濃度的NAA和6-BA配合使用時(shí)，狼尾草愈傷組織均出現(xiàn)不同程度的分化(表7)。愈傷組織分化培養(yǎng)基E7的分化率最高，為60%。培養(yǎng)基E3和E6的分化率均較低，且伴有褐化現(xiàn)象(圖2-Ⅲ)。

2.2.2NAA、6-BA、KT組合對(duì)狼尾草愈傷組織分化的影響 各激素組合的培養(yǎng)基中F3的分化率最高，為56.7%(表8)。分析各因素的極差，由大至小的順序?yàn)镽A(15.567)>RB(12.233)>RC(4.433)，說明各因素對(duì)愈傷組織分化率的作用大小為NAA>6-BA>KT濃度。NAA對(duì)愈傷組織分化的作用較明顯，以0.5～1.0 mg·L-1與3.0 mg·L-16-BA配合效果最佳。

表5 愈傷組織誘導(dǎo)中 2,4-D、NAA、KT配組的正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果

表6 愈傷組織誘導(dǎo)中2,4-D、KT、6-BA配組的正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果

低濃度NAA和高濃度6-BA有利于愈傷組織的分化，分化率可達(dá)60%，NAA、6-BA和KT配合使用時(shí)，愈傷組織分化率最高達(dá)56.7%，可見KT對(duì)愈傷組織的分化無顯著影響。綜合以上研究，最適合紫穗狼尾草的愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 3.0 mg·L-1。

圖2 狼尾草愈傷組織分化結(jié)果

表7 愈傷組織分化中NAA與6-BA組合的正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

狼尾草的離體培養(yǎng)及植株再生是切實(shí)可行的[8]，關(guān)于建立狼尾草再生體系的研究中，先后出現(xiàn)了以狼尾草幼穗[9]、莖節(jié)和頂芽[8]為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，然后分化成植株的報(bào)道，但污染率高、誘導(dǎo)率及分化率低等問題普遍存在。本試驗(yàn)采用成熟種子預(yù)先培養(yǎng)外植體的方法[10]，其操作簡單、成功率高。在此過程中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在組織培養(yǎng)的過程中也擔(dān)任重要的角色。培養(yǎng)基中添加的外源激素組合及濃度直接影響體細(xì)胞愈傷組織的誘導(dǎo)及分化。

本研究采用正交設(shè)計(jì)和方差分析，通過對(duì)影響紫穗狼尾草外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的外源激素進(jìn)行分析，初步找出了主要影響愈傷誘導(dǎo)及分化的激素組合,使得紫穗狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均有所提高。如在NAA、2,4-D和KT激素配比中愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)84%，在NAA和6-BA激素配比中最高分化率可達(dá)60%，高于繆珊和范繼紅[11]的研究結(jié)果(44%)。在不同植物激素種類配比中，2,4-D對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有決定性作用，在缺乏2,4-D的培養(yǎng)基中不能產(chǎn)生愈傷組織。生長素NAA和KT的作用相近，均以0.5～1.0 mg·L-1的濃度范圍對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)起促進(jìn)作用，過低則作用不明顯，而過高又會(huì)抑制愈傷組織的形成。在愈傷組織分化中NAA的作用顯著，且以較低濃度(0.5～1.0 mg·L-1)與較高濃度(3.0 mg·L-1)6-BA配合使用時(shí)效果最佳，NAA達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)就會(huì)有褐化現(xiàn)象發(fā)生。KT對(duì)于愈傷組織分化的作用不明顯，從節(jié)約成本的角度可以少用甚至可以不用。

表8 愈傷組織分化中NAA、6-BA、KT配組的正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果Tab.8 The results of L9(34)orthogonal test for NAA combined with 6-BA and KT on callus differentiation

本研究探討了不同外源激素對(duì)狼尾草愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，優(yōu)化了狼尾草植株再生體系，為利用分子育種等方法改良紫穗狼尾草的農(nóng)藝學(xué)性狀奠定基礎(chǔ)。

[1] 武菊英.觀賞草及其在園林景觀中的應(yīng)用[M].北京：中國林業(yè)出版社,2008:104.

[2] 武菊英,滕文軍,王慶海.狼尾草的生物學(xué)特性及在園林中的應(yīng)用[J].中國園林,2005(12):57-59.

[3] Llewellyn L M，Jerry C L.Xeriscape Ornamental Perennial Grass Trial for Low Water Use Landscaping[R].Annual Report,Horticulture Section,2002.

[4] Wolfe J III,Zajicek J M.Are ornamental grasses acceptable alternatives for low maintenance landscapes[J].Journal of Environmental Horticulture,1998(1):8-11.

[5] 張懷山.9個(gè)國產(chǎn)狼尾草野生種的特征特性與栽培利用研究[J].試驗(yàn)研究,2009(12):18-21.

[6] 李俊明編譯.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1996.

[7] 杜敏華,柴春月.日本結(jié)縷草離體培養(yǎng)及高頻率植株的再生[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007(10):17-19.

[8] 王憑青,段傳人,王伯初.雜交狼尾草不同外植體材料組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005(6):118-120.

[9] 繆珊,范繼紅.絨毛狼尾草幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,38(2):255-258.

[10] 龔束芳,張瀚儷,張曉瑩,等.狼尾草成熟種子的無菌播種與組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2010(6):116.