瘋草內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀與存在問題

周啟武，白 松，路 浩，趙寶玉，陳基萍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.西藏農(nóng)牧廳畜牧技術(shù)推廣總站，西藏 拉薩 850000)

瘋草(Locoweed)是豆科棘豆屬(Oxytropis)和黃芪屬(Astragalus)中能引起家畜以慢性神經(jīng)機(jī)能紊亂為特征中毒癥狀的有毒植物統(tǒng)稱[1]，其種類多，抗逆性強(qiáng)，在荒漠草原上生長旺盛，且返青早，枯萎遲，分布廣泛。其他牧草缺少或長勢不好時，長期或大量采食瘋草可引起大批動物中毒甚至死亡，稱為“瘋草中毒”(Locoism)。國外，瘋草主要分布于美國、加拿大、墨西哥、俄羅斯、西班牙、冰島、摩洛哥和埃及等國家，其中以美國西部最為嚴(yán)重。在我國主要分布于內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅、青海、西藏、新疆、四川和云南等省區(qū)。瘋草現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)危害草原畜牧業(yè)最為嚴(yán)重的毒草，瘋草毒性災(zāi)害被列入世界性“生態(tài)經(jīng)濟(jì)病”之一。自1873年美國首次報道瘋草中毒以來，人們經(jīng)過一百多年的研究，現(xiàn)已確證引起瘋草中毒的主要毒性物質(zhì)是吲哚里西啶生物堿苦馬豆素(Swainsonine，SW)[2-3]。

內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史中某一段時期內(nèi)或整個生命時期生活于植物組織內(nèi)部，對其宿主不引起明顯疾病的一類真菌，包括腐生真菌、病原真菌和菌根菌[4]。19世紀(jì)末，Hanausek[5]、Vogl等[6]就首次報道過有內(nèi)生真菌感染了黑麥草(Loliumtemulentum)的種子，但沒有得到重視，直到20世紀(jì)30年代發(fā)生牲畜黑麥草中毒造成畜牧業(yè)重大損失，發(fā)現(xiàn)主要原因是采食了感染能產(chǎn)生生物堿毒素的內(nèi)生真菌的黑麥草，內(nèi)生真菌的研究才得以廣泛深入地開展起來。經(jīng)過一百多年研究，國外已由最初的發(fā)現(xiàn)、檢測、分類和分離培養(yǎng)內(nèi)生真菌，深入到內(nèi)生真菌與宿主植物互作關(guān)系、抗性機(jī)制和群體特征以及代謝產(chǎn)物活性的研究。我國對內(nèi)生真菌的研究起步相對較晚，最早見于1985年李揚(yáng)漢[7]對不同種或變種毒麥籽實(shí)糊粉層以外菌絲層的有無，感染真菌的籽實(shí)與毒性的關(guān)系，內(nèi)生真菌在分類學(xué)上的地位，感染來源以及真菌與寄主之間的關(guān)系所做的討論。直到1994年邱徳有等[8]才首次報道從云南紅豆杉(Taxusyunnanensis)樹皮中分離出一種可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。僅20年左右的研究歷史，已引起真菌學(xué)、植物學(xué)、化學(xué)、藥物學(xué)等學(xué)科的廣泛關(guān)注。

1985年，美國學(xué)者Braun[9]首次從綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)中分離獲得SW純品，隨后發(fā)現(xiàn)豆類絲核菌(Rhizoctonialeguminicola)和埃里磚格孢屬真菌(Embellisiaspp.)也能產(chǎn)SW。因此，人們推測瘋草內(nèi)生真菌與SW之間有著極為密切的關(guān)系，并相繼從多種瘋草中分離到產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌。隨著研究的深入，有關(guān)瘋草內(nèi)生真菌生物多樣性、瘋草內(nèi)生真菌與SW合成關(guān)系、瘋草內(nèi)生真菌與瘋草抗逆性以及SW毒理和藥理活性等已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。SW良好的抗腫瘤活性和免疫增強(qiáng)作用，目前國外二期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成[10]。我國瘋草面積超過1 100萬hm2，雖然為SW的研究和開發(fā)提供了充足的來源，但由于瘋草中SW含量較低，提取技術(shù)有限，而且面臨植物資源消耗造成草地沙漠化等嚴(yán)重生態(tài)問題，直接從瘋草中提取SW已不是一種理想的方法。因此，通過生物發(fā)酵獲取內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物，擴(kuò)大SW來源以及進(jìn)行批量生產(chǎn)，已成為獲取SW的新途徑。為此，就國內(nèi)外瘋草內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀、經(jīng)濟(jì)價值以及存在問題等方面進(jìn)行簡要綜述，為今后瘋草內(nèi)生真菌深入研究提供參考。

1 瘋草內(nèi)生真菌多樣性、分布及定植規(guī)律

內(nèi)生真菌廣泛存在于自然界中，由于自然地理?xiàng)l件和宿主植物的差異，造就了植物內(nèi)生真菌種屬的多樣性。Petrini[11]推測，每種植物平均有4～5種專性內(nèi)生真菌，全世界內(nèi)生真菌種類在100萬種以上。孫劍秋等[12]報道，近十多年來人們已從47 科81屬114 種3變種藥用植物中分離到內(nèi)生真菌達(dá)171屬，涉及子囊菌、擔(dān)子菌、接合菌、卵菌、有絲分裂孢子真菌及其無孢菌類等真菌類群。內(nèi)生真菌多樣性不僅表現(xiàn)于其在自然界中龐大的種屬數(shù)量，而且同一植物的同一組織內(nèi)內(nèi)生真菌也存在多樣性。從一種植物中可分離到的內(nèi)生真菌通常為數(shù)種至數(shù)十種，有的甚至多達(dá)數(shù)百種，這些內(nèi)生真菌的存在對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡發(fā)揮著重要作用。瘋草具有地理分布的廣泛性和種類多樣性，因此其內(nèi)生真菌也呈現(xiàn)生物多樣性特點(diǎn)，多年來人們已從瘋草中分離出多種內(nèi)生真菌(表1)。

目前，國內(nèi)外所分離到的瘋草內(nèi)生真菌主要是埃里磚格孢屬(Embellisiaspp.)，此屬真菌種類繁多，自然界分布較廣泛，生境非常復(fù)雜，一些種還能夠引起植物的病害。Li和Nan[28]報道，沙打旺埃里磚格孢菌(E.astragali)能引起直立黃芪(Astragalusadsurgens)黃矮根腐病，是導(dǎo)致其早衰的主要原因。但至今未發(fā)現(xiàn)埃里磚格孢屬真菌能引起與其共生的瘋草類植物發(fā)生病變。

盧萍[25]對中國內(nèi)蒙古3種瘋草中SW相關(guān)因子研究表明，菌絲體在瘋草種子中密度最高，主要分布于糊粉層中，胚組織內(nèi)分布很少，在植株?duì)I養(yǎng)器官中，以近地面莖基部組織中菌絲體密度最高，其次為葉鞘。Braun等[16]從11個瘋草種群中的8個分離到產(chǎn)SW的埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)葉子侵染率為72.9%、莖97.2%、種子93.1%、花100%。說明瘋草內(nèi)生真菌在侵染植株定植時具有一定的組織選擇性，可能是由于不同組織營養(yǎng)成分的差異或通過種子向植株傳播過程的缺陷造成。此外，不同植株內(nèi)生真菌的種類、基因型是不相同的，內(nèi)生真菌對宿主植物也具有選擇性，同一種內(nèi)生真菌與一種植物能形成內(nèi)共生關(guān)系，而與另外一種植物就無法形成內(nèi)共生關(guān)系，這可能與植株生長環(huán)境以及宿主植物基因型差異有關(guān)。

2 瘋草內(nèi)生真菌檢測、分離鑒定與菌種保藏

Patriquin和D?bereiner[29]1978年用光鏡觀察四唑減少巴西玉米和其他牧草根際環(huán)境細(xì)菌時發(fā)現(xiàn)，苯胺藍(lán)可將真菌原生質(zhì)體染成藍(lán)色，于是建立了最初的苯胺藍(lán)染色檢測植物組織內(nèi)生真菌的方法，此法簡便易行, 至今仍廣泛使用。此外，一些先進(jìn)技術(shù)手段如酶聯(lián)免疫分析、近紅外反射光譜分析也被用于定量檢測，有人也以內(nèi)生真菌代謝物如麥角堿等作為指示劑測定內(nèi)生真菌[30]。目前，分子生物學(xué)方法如PCR特異擴(kuò)增技術(shù)也能快速、準(zhǔn)確檢測植物內(nèi)生真菌的存在。Cook等[19]成功應(yīng)用qPCR方法從美國3種瘋草中檢測到內(nèi)生真菌的存在，方法簡便、快速，檢測限達(dá)到0.2 pg·ng-1總DNA，大大提高了植物中內(nèi)生真菌檢測水平。

植物內(nèi)生真菌分離方法已很成熟，且成功用于瘋草內(nèi)生真菌的分離[14,23，31]。對于內(nèi)生真菌種屬鑒定，通常是在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合真菌核糖體rDNA-ITS保守序列測定完成的[32]。盧圍等[29]從采自內(nèi)蒙古的小花棘豆樣品的莖和花中分離到兩株產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)與核糖體rDNA-ITS序列測序鑒定為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)。但隨著研究的深入及更多菌株的發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的rDNA-ITS分類方法由于其較低的分辨率已不能滿足菌株精細(xì)鑒定的需要，現(xiàn)已利用6～7個基因片段從多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的角度對某一真菌個體進(jìn)行精確的定位分類[33-34]。

為保證菌株在保藏過程中純度、活性、基因信息的完整性，避免菌株變異和降低退化，目前適用的真菌保藏方法主要有3種[35]：1)不斷將菌株移植在新鮮培養(yǎng)基上，并在適宜條件下生長，隨后置于低溫(4～10 ℃)環(huán)境中讓其連續(xù)生長，主要包括斜面移植、油管保藏和蒸餾水保藏法等。2)利用干燥環(huán)境(空氣、硅膠、土壤、沙子等)保藏菌株休眠體(分生孢子、厚垣孢子等)。3)通過脫水降低細(xì)胞內(nèi)水分或低溫冷凍抑制菌株代謝活性以達(dá)到長期保藏，包括冷凍干燥法、低溫凍結(jié)和液氮保藏法等。其中，第1種是目前瘋草內(nèi)生真菌保藏過程中最常采用的方法，且多以斜面移植后低溫保藏[21,25,27]。

表1 國內(nèi)外瘋草內(nèi)生真菌的種屬多樣性

3 瘋草內(nèi)生真菌與瘋草互作關(guān)系

瘋草-內(nèi)生真菌-家畜的關(guān)系集中反映了草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物與微生物、植物與動物、微生物與動物之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系(圖1)。對此，不同學(xué)者持不同的見解，有的將其描述為內(nèi)生真菌與宿主植物互惠互利的共生關(guān)系[37]；有的則認(rèn)為是特殊的寄生關(guān)系，而這種寄生一般不引起植物相關(guān)病癥，當(dāng)植物衰老或受到環(huán)境脅迫時又會變成病原菌而引起植物病害，即內(nèi)生真菌與瘋草之間是一種處于動態(tài)平衡的拮抗關(guān)系[38]。正是瘋草-內(nèi)生真菌共生體的雙重特性，尤其是內(nèi)生真菌-瘋草共生關(guān)系對植物的影響顯著，已引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[2,39]。

圖1 瘋草-內(nèi)生真菌相互作用及其對家畜的影響(改自南志標(biāo)和李春杰，2004[36])

3.1內(nèi)生真菌促進(jìn)瘋草生長發(fā)育 Ralphs等[14]從部分棘豆屬和黃芪屬植物中分離到內(nèi)生真菌，其感染程度與SW含量呈正相關(guān)，而未檢測出內(nèi)生真菌的棘豆屬和黃芪屬植物，經(jīng)GC-MS檢測，SW含量甚微，說明內(nèi)生真菌(Embellisiaspp.)能夠增加SW的生物合成。Valdez Barillas等[17]研究絹毛棘豆與SW關(guān)系表明，當(dāng)土壤中缺乏氮元素時，無根瘤菌與有根瘤菌絹毛棘豆植株SW含量從0.084%提高到0.114%，最高達(dá)到0.175%，這主要是根瘤菌固氮作用產(chǎn)生天冬氨酸在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為賴氨酸被內(nèi)生真菌用來合成SW，并發(fā)現(xiàn)大量內(nèi)生真菌分布于光合作用強(qiáng)、賴氨酸濃度高的植物葉莖的葉綠體中，較好地解釋了葉綠素多的棘豆莖、葉中SW含量較高的原因。盧萍[25]研究發(fā)現(xiàn)，在植物(Astragalusoxyphysus)和真菌(Rhizoctonialeguminicola)中SW的合成都是通過相同途徑由六氫吡啶羧酸(Pipecolic acid)而來，內(nèi)生真菌的感染可能加強(qiáng)或補(bǔ)充了SW的產(chǎn)量。因此，瘋草內(nèi)生真菌促進(jìn)植株生長發(fā)育主要體現(xiàn)在增加SW的合成方面。資料顯示，瘋草內(nèi)生真菌感染程度與瘋草毒素——SW生物合成量呈正相關(guān)(表2)。而且，Cook等[18,20]最近用LC-MS方法將瘋草(絹毛棘豆、密柔毛黃芪和斑莢膜黃芪)分為含SW(SW>0.1%)和不含SW(SW<0.01%)的兩大類群，并通過qPCR檢測相應(yīng)組織中內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis的含量，發(fā)現(xiàn)含有SW的瘋草組織中內(nèi)生真菌含量是不含SW瘋草相應(yīng)組織中的10倍(根部3倍)以上，而不含SW的瘋草組織中檢測不到內(nèi)生真菌的存在；且組織中SW濃度與內(nèi)生真菌含量的變化不一致，如密柔毛黃芪花冠中內(nèi)生真菌含量(12.1pg·ng-1)比花(4.0pg·ng-1)中高，但花中SW濃度(0.26%)卻比花冠(0.70%)中高許多。這說明內(nèi)生真菌Undifilumoxytropis在瘋草SW合成過程中起著主導(dǎo)作用，但可能因?yàn)閮?nèi)生真菌在植物活組織中移行分布而導(dǎo)致檢測出組織中SW濃度與內(nèi)生真菌含量變化不一致。

表2 瘋草中內(nèi)生真菌感染量與苦馬豆素濃度的關(guān)系[15]

3.2內(nèi)生真菌增強(qiáng)瘋草抗逆性 資料表明，內(nèi)生真菌侵染還可增強(qiáng)宿主植物的抗逆性[38]，瘋草多生長于干旱、半干旱地區(qū)，一般具有耐寒、耐旱、生命力強(qiáng)、繁殖率高等特點(diǎn)，局部地區(qū)蓋度和生物量均超過其他牧草，這與瘋草-內(nèi)生真菌互惠互利的共生體存在密切相關(guān)[40]。Richardson等[41]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，感染內(nèi)生真菌的高羊茅植株葉片和葉鞘中通過積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)多元醇(甘露醇、阿拉伯糖醇)以及葡萄糖和果糖來提高植株的滲透勢和再生能力，而在未感染植株中，這些物質(zhì)含量相對較少。另外，感染內(nèi)生真菌植株偏重于根系生長，未感染植株則偏重于地上部分生長[42]。有發(fā)達(dá)的根系，抗旱能力就更強(qiáng)，而且其葉片更加寬厚，卷曲更嚴(yán)重，能有效避免水分蒸發(fā)，從而提高植株的抗旱性[43]。Castillo等[44]評估不同溫度條件下水分脅迫對瘋草種子萌芽的影響，結(jié)果表明，夏秋季節(jié)密柔毛黃芪在荒漠草地低濕土壤條件下并不影響其萌芽。Ralphs等[14]研究瘋草中SW與內(nèi)生真菌(Embellisiaspp.)間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瘋草-內(nèi)生真菌共生體在干旱脅迫或低pH值環(huán)境生長時，SW含量會顯著增加，且生長在干旱環(huán)境的瘋草比對照組植株更高更茂盛，其干質(zhì)量明顯高于對照組。程翠等[45]發(fā)現(xiàn)，在滲透脅迫和磷脅迫情況下內(nèi)生真菌均可促進(jìn)小花棘豆幼苗生長。此外，內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生或協(xié)同瘋草產(chǎn)生有毒生物堿-SW，致使食草動物(主要是山羊和綿羊)一般都不愿采食瘋草類植物，因而導(dǎo)致瘋草大量生長，優(yōu)質(zhì)牧草卻被過度采食，致使草地供養(yǎng)能力下降。因此，瘋草-內(nèi)生真菌共生體從生物脅迫與非生物脅迫兩方面都增強(qiáng)了瘋草的抗逆性，以致草原出現(xiàn)毒草化，嚴(yán)重破壞了草原生態(tài)及影響畜牧業(yè)的發(fā)展。

4 瘋草內(nèi)生真菌經(jīng)濟(jì)價值

內(nèi)生真菌的物種多樣性決定了其代謝產(chǎn)物的多樣性。大量研究結(jié)果表明，植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，在這些代謝產(chǎn)物中，有些是與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)，有些是新物質(zhì)，具有特殊的生理功能[12]?，F(xiàn)已證明瘋草中SW含量與內(nèi)生真菌感染程度呈正相關(guān)，并已從瘋草中分離到可產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌，說明SW是瘋草內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物[14,27]。

SW具有抗腫瘤、抗病毒感染、增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及潛在的抗艾滋病病毒等多種藥用活性[46-48]。Dennis等[49]首次報道SW單用或結(jié)合α-干擾素能抑制體內(nèi)HT29結(jié)腸癌生長，其抗癌作用在于SW對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷和提高機(jī)體免疫功能的雙重作用。SW還具有刺激骨髓細(xì)胞增值分裂的活性，同時具有抗輻射活性，能降低放療治療癌癥時對患者的副作用[50]。陳紹淑等[51]用SW對人胃癌生長及轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)證明，SW具有明顯的腫瘤抑制作用。SW鹽酸鹽對小鼠腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也表現(xiàn)出抑制作用。劉文明等[52]研究了SW對MDV感染雞血液學(xué)指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示，SW能夠維持試驗(yàn)雞白細(xì)胞水平，使試驗(yàn)雞能更好地防御MDV的侵害。Tanaka等[53]采用SW抑制α-甘露糖苷酶的特性，從而阻止副流感病毒(HPIV3)表面蛋白的初步合成，抑制病毒糖基化修飾而達(dá)到抗病毒作用。美國已經(jīng)把SW及其衍生物作為抗艾滋病病毒藥物進(jìn)行了研究[54-55]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠衰竭的NK細(xì)胞中，SW并不對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，說明SW抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能是增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用[54]。

雖然SW良好的抗腫瘤活性和增強(qiáng)免疫作用已引起人們的關(guān)注，但因SW來源匱乏問題一直制約著SW藥理活性研究與開發(fā)的進(jìn)程。從瘋草植物中分離篩選產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)SW具有很大的發(fā)展前景，生物發(fā)酵與植物提取和化學(xué)合成相比具有成本低，不易造成草原生態(tài)破壞，發(fā)酵條件易控制，且對環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)。Mclain-Romero等[13]從絹毛棘豆、密柔毛黃芪、蘭伯氏棘豆的葉、莖、花及種子中分離的內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)條件下均可單獨(dú)產(chǎn)生SW。Braun等[16]從美國瘋草中分離到可以產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌埃里磚格孢菌(Embellisiaspp.)，通過體外發(fā)酵培養(yǎng)，從其代謝產(chǎn)物中檢測出SW，有內(nèi)生真菌的植物種群含SW，且內(nèi)生真菌與宿主植物中SW水平高度相關(guān)。余永濤等[21,24]、盧萍等[56]、Li和Nan[28]也分別從甘肅棘豆(O.kansuensis)和小花棘豆(O.glabra)中分離得到同一種棘豆埃里磚格孢菌(Embellisiaoxytropis)，這說明我國瘋草中也可能含有產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌，有望科研工作者從我國瘋草中分離篩選出產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌，并通過工藝發(fā)酵合成SW，為其臨床應(yīng)用及相關(guān)研究提供充足的來源。

此外，內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)方面也具有很好的應(yīng)用前景，如植物生長調(diào)節(jié)劑、品種的培育和改良、生物防治等[57]。瘋草主要分布于溫帶高寒、干旱半干旱地區(qū)，對惡劣環(huán)境有很好的抗性，這與內(nèi)生真菌感染程度相關(guān)[40]?，F(xiàn)已明確，瘋草致毒的主要原因是埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌的侵入[58]，并且Ralphs等[15]也證實(shí)瘋草內(nèi)生真菌幾乎是通過垂直傳播(母系傳播)到下一代的。因此，可以利用瘋草與內(nèi)生真菌之間的關(guān)系，采取適當(dāng)措施控制瘋草內(nèi)生真菌，為動物瘋草中毒病的防治和瘋草資源的合理利用提供新思路。例如，采用克隆特異性功能基因等生物技術(shù)，對有毒埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌進(jìn)行脫毒變異，人工接種到瘋草植株上，改瘋草為有益牧草，改良牧草品質(zhì)和微生物特性，創(chuàng)造新種質(zhì)[59]。目前，美國、澳大利亞、新西蘭和歐洲一些國家的種子公司都提供內(nèi)生真菌感染率高的牧草種子，經(jīng)調(diào)查這些植物的抗性(抗旱、抗寒、抗病蟲害等)相對于其他未感染內(nèi)生真菌的植物要高[60]。

5 存在問題

盡管人們在瘋草內(nèi)生真菌的生態(tài)分布、分離鑒定、菌種保藏及代謝產(chǎn)物等方面做了一些工作，但瘋草內(nèi)生真菌還存在諸多問題有待人們?nèi)ソ鉀Q。

1)內(nèi)生真菌研究手段和方法有待提高，包括內(nèi)生真菌的檢測、分離和鑒定等。據(jù)目前研究來看，瘋草中分離到的內(nèi)生真菌絕大部分是埃里磚格孢屬，很難揭示瘋草中內(nèi)生真菌多樣性。其原因可能是有些內(nèi)生真菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，或有些快生型內(nèi)生真菌抑制了慢生型內(nèi)生真菌的生長，不能將生活在瘋草內(nèi)的所有真菌全部分離出來，且有些已分離到的內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可育性孢子，就會由于菌絲體的死亡而造成菌種丟失而難以鑒定菌種類型，因此不能準(zhǔn)確地反映出瘋草內(nèi)生真菌的數(shù)量和種群。

2)瘋草內(nèi)生真菌的來源及入侵宿主的分子機(jī)理仍不明確。目前雖知道瘋草內(nèi)生真菌主要是通過垂直傳播，其次一些產(chǎn)孢真菌的成熟孢子可通過外界環(huán)境傳播到其他植株。但關(guān)于瘋草內(nèi)生真菌到底是由植物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器(如葉綠體等)演變而來，還是通過植物感染(根際土壤或空氣感染)外界真菌后形成共生體以及此共生體的形成機(jī)制，目前仍沒有試驗(yàn)證實(shí)，也沒有成熟的分子機(jī)制作為其理論依據(jù)。

3)內(nèi)生真菌與宿主的關(guān)系及內(nèi)生真菌對瘋草組織的專一性、分布等生命活動機(jī)理研究較少。對內(nèi)生真菌與瘋草之間關(guān)系的研究，目前主要集中在內(nèi)生真菌對瘋草SW含量的影響方面，但對于內(nèi)生真菌如何增強(qiáng)瘋草的抗逆性及在種群中的競爭優(yōu)勢研究較少；其次內(nèi)生真菌分布于植物體內(nèi)，并在定植組織時具有一定的選擇性，致使有些內(nèi)生真菌可以在宿主科的水平上具有專一性，有的在宿主種的水平上具有專一性[37]，對于內(nèi)生真菌在植株內(nèi)和植株間分布特點(diǎn)、機(jī)理的研究報道相對較少，也有待于進(jìn)一步深入探討。

4)內(nèi)生真菌產(chǎn)生與瘋草相同的生物活性物質(zhì)——SW的遺傳機(jī)制還不清楚。目前，國內(nèi)外關(guān)于瘋草內(nèi)生真菌產(chǎn)生與瘋草相同的生物活性物質(zhì)SW，是因?yàn)閮?nèi)生真菌從宿主植物獲得了相關(guān)基因的直接傳遞而具有了相同的次級代謝產(chǎn)物合成途徑，還是因?yàn)閮?nèi)生真菌與其宿主植物經(jīng)長期的共同生活，相互之間的影響使得某些基因可以在植物與內(nèi)生真菌之間相互作用過程中發(fā)生傳遞的遺傳機(jī)制還不清楚。此外，瘋草埃里磚格孢菌是近年來豆科植物上首次發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌[61]，且現(xiàn)已證實(shí)其能夠單獨(dú)或協(xié)同瘋草產(chǎn)生SW，而對于其他含有埃里磚格孢菌的植物如直立黃芪(A.adsurgens)體內(nèi)是否含有SW，以及瘋草埃里磚格孢菌侵染其他植物后是否可以產(chǎn)生SW尚未見報道，均有待于進(jìn)一步研究。

總之，我國瘋草類植物資源極為豐富，面積約有1 100萬hm2以上，每年造成10億元的經(jīng)濟(jì)損失，美國每年僅因家畜采食絹毛棘豆和密柔毛黃芪就造成2.34億美元的損失[62]。但瘋草毒素——SW卻有誘人的醫(yī)用價值，因此，如果能夠解決上述問題，探明瘋草內(nèi)生真菌及其共生體產(chǎn)生SW的生理、生化機(jī)制，不僅可為預(yù)防動物瘋草中毒的發(fā)生，減少對畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，以及保護(hù)草原群落多樣性具有重要現(xiàn)實(shí)意義，而且可為利用瘋草內(nèi)生真菌生產(chǎn)SW提供理論依據(jù)，促進(jìn)SW在臨床醫(yī)學(xué)上的普遍使用，以造福人類。

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