游泳池水氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果影響的組織病理學(xué)與代謝組學(xué)研究

李江華，王智慧，朱小娟，葛耀軍

1 前言

由于使用和投加方便，價(jià)格低廉，氯化消毒一直是游泳池水處理的主要方式。然而研究表明，傳統(tǒng)的含氯消毒劑，如液氯、漂白粉（次氯酸鈣）等，在殺死水中致病微生物的同時(shí)，又與水中的其他化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成了各種新的毒性物質(zhì)，統(tǒng)稱為氯化消毒副產(chǎn)物［17］。游泳池水質(zhì)問題，近年來在西方發(fā)達(dá)國家已經(jīng)引起了高度重視，目前，美國、澳大利亞等游泳強(qiáng)國已基本淘汰了舊的氯化消毒方式，被稱為第四代殺菌消毒劑的二氧化氯已經(jīng)成為游泳池水處理的主要方式，國際泳聯(lián)（FINA）制定的游泳池水質(zhì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)也已經(jīng)對某些氯化消毒副產(chǎn)物的含量做出了明確的規(guī)定［16］。在國內(nèi)，雖然毒性及危險(xiǎn)性極大的液氯也已經(jīng)逐步退出游泳池水處理市場，但是投放次氯酸鈣仍然是游泳池水處理的主要方式。據(jù)報(bào)道，長期在傳統(tǒng)氯化消毒游泳池水中游泳可能導(dǎo)致呼吸功能受損，患哮喘的幾率顯著提高［17］。至于傳統(tǒng)的氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果的影響，目前鮮見有相關(guān)的報(bào)道，我國與游泳強(qiáng)國游泳水平的差距是否與游泳池水質(zhì)有關(guān)也不清楚。進(jìn)行本項(xiàng)目的研究，一方面，可以了解傳統(tǒng)氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果的影響，為游泳項(xiàng)目訓(xùn)練提供科學(xué)依據(jù)；另一方面，利用組織病理學(xué)和基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析，對這種影響產(chǎn)生的原因及其生理、生化機(jī)制進(jìn)行研究，為發(fā)展相應(yīng)的預(yù)防方法或措施提供理論支持。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

3周齡健康雄性SD大鼠12只，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，清潔級實(shí)驗(yàn)動物。平均體重207.1±43.9g，采用國家標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料分籠喂養(yǎng)（飼料由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供），自由飲食，室溫20℃～24℃，自然光照。

2.2 分組與訓(xùn)練

12只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（C組）與實(shí)驗(yàn)組（E組），每組各6只，分別進(jìn)行為期10周的漸增負(fù)荷游泳訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)組游泳池水按照普通游泳池水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)投入次氯酸鈣，使余氯量達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（0.3～0.5mg/L）；對照組游泳池水為經(jīng)過美的凈水機(jī)過濾后的自來水，不添加任何消毒劑。每周訓(xùn)練5天，每天1次，每次訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間以大鼠個(gè)體是否出現(xiàn)疲勞為準(zhǔn)。負(fù)重量：正式訓(xùn)練第1周負(fù)重量為大鼠平均體重的2％，以后每2周在原有基礎(chǔ)上增加1％，一直增加至大鼠平均體重的5％為止；疲勞標(biāo)準(zhǔn)：大鼠鼻尖2次沉于水中5s以上，判斷為疲勞［7］，出現(xiàn)疲勞的大鼠停止訓(xùn)練，并及時(shí)撈出。

2.3 游泳測試與取樣

10周訓(xùn)練結(jié)束后，首先利用代謝籠收集尿樣（24h），EP管密封，-80℃冰箱保存，以備一維核磁共振氫譜（1H NMR）測試與代謝組學(xué)分析。尿樣收集完后，進(jìn)行負(fù)重耐力游泳能力測試：測試時(shí)統(tǒng)一使用自來水為游泳用水，負(fù)重量約為平均體重的5％，入水開始計(jì)時(shí)，游至力竭停止計(jì)時(shí)，分別記錄每只大鼠游泳至力竭的時(shí)間。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠水中旋轉(zhuǎn)、運(yùn)動協(xié)調(diào)性明顯下降，水淹沒鼻尖，身體下沉至水面超過10s［27］。負(fù)重耐力游泳能力測試完成后，大鼠休息2天（48h），斷頭處死，取肺臟進(jìn)行組織病理切片。

2.41H NMR測試與組織病理切片

尿樣于室溫下解凍，每個(gè)尿液樣品取400μl，加入200μl磷酸緩沖液（0.3M，pH7.4），10％重水（D2O，鎖場），0.05％TSP（內(nèi)標(biāo)）。靜置10min，再于4℃、13 000g離心10min，取上清入5mm核磁管進(jìn)行1H NMR測量，磁場共振頻率400.13MHz，譜寬16.02ppm，掃描次數(shù)32，溫度30℃，預(yù)飽和方式壓水峰，脈沖序列NOESYPR1D。

從肺的同一部位切一小塊，4％的多聚甲醛緩沖固定液中固定12h，常規(guī)組織病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.51H NMR代謝組學(xué)分析

與傳統(tǒng)生物學(xué)將生命現(xiàn)象與少數(shù)幾個(gè)生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)研究的方法相反，代謝組學(xué)利用整體的分析方法對生命系統(tǒng)進(jìn)行研究，通過測量樣本中的所有的代謝產(chǎn)物來反映生物體對不同刺激的反應(yīng)［3］。由于哺乳動物的代謝產(chǎn)物主要通過尿液排出，基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)研究通常以尿液作為研究對象，利用1H NMR產(chǎn)生數(shù)據(jù)。氫原子在不同分子中的化學(xué)環(huán)境不同，在1H NMR中顯示出不同的吸收峰，其中峰的數(shù)量就是氫的化學(xué)環(huán)境的數(shù)量，而峰的強(qiáng)度（也稱為面積），就對應(yīng)處于某種化學(xué)環(huán)境中的氫原子的數(shù)量。由于尿液1H NMR完整地反映了該實(shí)驗(yàn)對象的代謝表型與代謝特征，被稱為“代謝指紋圖譜”。簡而言之，尿液1H NMR上不同的譜峰代表了尿液中不同的代謝物，譜峰的面積則反映了該代謝物的相對濃度；哺乳動物的代謝產(chǎn)物基本上都包含氫，而NMR是目前惟一既能定性又能在微摩爾范圍對所有含氫代謝物同時(shí)進(jìn)行定量分析的技術(shù)［13］。

2.5.1 譜圖處理與產(chǎn)生數(shù)據(jù)

Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China.

利用軟件MestReC4.9.9.6對所測得的1H NMR進(jìn)行手動相位和基線校正，以TSP共振峰為參考調(diào)零。然后對10～0.04ppm進(jìn)行分段積分，每段0.04ppm，為了消除核磁共振采集信號過程中壓水峰所造成的影響，去除了水峰和尿素峰附近6.2～4.4ppm這一區(qū)段。結(jié)果從每張氫譜獲得了204個(gè)相應(yīng)的積分?jǐn)?shù)據(jù)。在模式識別和進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)與分析前，每段的積分?jǐn)?shù)據(jù)相對于每張氫譜的總積分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［5］。

2.5.2 模式識別

哺乳動物尿液中的代謝物組成復(fù)雜，眾多的小分子代謝物通常會在1H NMR產(chǎn)生成千上萬的共振峰［19］，要想解讀如此復(fù)雜的信息，就必須借助以計(jì)算機(jī)信息技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的模式識別技術(shù)［9］。偏最小二乘法（PLS）是一種集多元線性回歸法和主成分分析（PCA）的基本功能于一體的、對高維度數(shù)據(jù)具有強(qiáng)大的處理能力的模式識別方法［4］。本研究采用SIMCA-P 10.0軟件包（瑞典，Umetrics-AB，Umea）進(jìn)行PLS模式識別和自變量因子重要性程度分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 耐力游泳測試成績

實(shí)驗(yàn)組大鼠游泳至力竭的時(shí)間為28.97±2.55min，對照組游泳至力竭的時(shí)間為39.15±9.85min，使用氯化消毒水進(jìn)行游泳訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組，結(jié)果具有顯著性意義（P＜0.05）。

3.2 組織病理學(xué)檢測

大體解剖可見，大鼠肺的顏色和大小均正常，未見有明顯滲出、增生、水腫、萎縮等病變。切片鏡下觀察顯示，無論是實(shí)驗(yàn)組還是對照組，大部分大鼠肺泡壁出現(xiàn)了毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔可見有水腫液（圖1），但是沒有發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變跡象，實(shí)驗(yàn)組和對照組檢測結(jié)果基本一致，沒有明顯差異。

圖1 大鼠肺組織電鏡圖（HE×100）

3.3 代謝組學(xué)

3.3.1 模式識別結(jié)果

PLS模式識別結(jié)果如圖2所示，在以第一主成分（t1）為橫坐標(biāo)，第二主成分（t2）為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖上，實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本被明確地分開了，而同組的樣本則各自聚集。這一結(jié)果表明，經(jīng)過10周的漸增負(fù)荷游泳訓(xùn)練后，實(shí)驗(yàn)組大鼠代謝表型（1H NMR代謝指紋圖譜）與對照組相比出現(xiàn)了明顯的、有群體性特征的變化。

圖2 偏最小二乘法（PLS）模式識別效果圖（t1vs.t2）

3.3.21H NMR譜峰重要性分析與代謝標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)

代謝組學(xué)通過代謝指紋圖譜來對生命系統(tǒng)進(jìn)行研究，1H NMR譜上成千上萬的共振峰代表著不同的代謝物，但是這些代謝物在樣本分類中的重要性并不相同，許多譜峰強(qiáng)度的組間差異很小，在分類中的作用甚至接近于零。如圖2所示，PLS分析通過提取主成分t1和t2達(dá)到了降維的目的，使得實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本在二維圖上出現(xiàn)了明顯的類聚現(xiàn)象，但是哪些代謝物在樣本分類中起主要作用？或者說主要是哪些代謝物的共振峰使得實(shí)驗(yàn)組和對照組的樣本出現(xiàn)了圖2中的類聚現(xiàn)象？PLS分析在實(shí)現(xiàn)降維的同時(shí)，還能對自變量因子的重要性進(jìn)行分析，即1H NMR譜上某一化學(xué)位移區(qū)段上譜峰的重要性程度可以用變量投影重要性指標(biāo)（variable importance in projection，VIP）來量化［4］，據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)組間差異大、在樣本分類中的重要性也高的譜峰及其所代表的代謝物。本研究中，VIP值較高的前3個(gè)、能較大程度反映實(shí)驗(yàn)組大鼠與對照組大鼠代謝表型差異的1H NMR譜區(qū)段依次為1.92～1.88ppm（VIP：2.62）、2.40～2.36ppm（VIP：2.45）4.00～3.96ppm（VIP：2.29）。譜峰歸屬結(jié)果如圖3所示，可見10周氯化消毒游泳池水游泳訓(xùn)練所引起的代謝表型變化的主要代謝標(biāo)志物為：γ-氨基丁酸、丙酮酸和馬尿酸。

圖3 一維核磁共振氫譜（1H NMR）重要區(qū)段代表性的代謝標(biāo)志物圖

3.3.3 實(shí)驗(yàn)組與對照組代謝標(biāo)志物相對含量的比較

VIP值較高的前3個(gè)1H NMR譜區(qū)段相對積分值比較結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的4.00～3.96ppm區(qū)段明顯高于對照組，而在1.92～1.88ppm和2.40～2.36ppm這2個(gè)區(qū)段的相對積分值則明顯低對照組，差異均具有非常顯著性意義。由于每段1H NMR譜相對積分值在一定程度上反映該區(qū)段主要物質(zhì)的相對濃度，結(jié)合圖3譜峰歸屬的結(jié)果可以得出：實(shí)驗(yàn)大鼠尿液中馬尿酸的相對含量較高，而γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量則較低。

圖4 重要的3個(gè)1H NMR譜區(qū)段相對積分值比較示意圖

4 討論

4.1 游泳池水氯化消毒的副作用的組織病理學(xué)分析

流行病學(xué)調(diào)查顯示，游泳池水氯化消毒對人體健康的危害主要體現(xiàn)在肺功能受損和引起哮喘。有研究顯示，經(jīng)常在氯化消毒游泳池中游泳，會導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞滲透性增加［20］，有引起哮喘和其他呼吸性疾病的危險(xiǎn)［24］。Thickett等人［28］通過對救生員和游泳教練的研究發(fā)現(xiàn)，空氣中的三氯化氮（一種氯化消毒副產(chǎn)物，Ncl3）濃度達(dá)到100～570mg/m3就可能引起職業(yè)性的哮喘。當(dāng)然，除哮喘以外，游泳池水氯化消毒副產(chǎn)物可能還與多種身體不適反應(yīng)有關(guān)［21］：研究顯示，Ncl3可能對救生員與游泳者的眼睛和上呼吸道具有強(qiáng)烈的刺激作用，Nystad等人［25］發(fā)現(xiàn)，游泳池游泳可引起幼兒呼吸道和耳朵感染反復(fù)發(fā)作；王春［11］曾對北京的部分游泳人群進(jìn)行過問卷調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示，43.3％的人在游泳后感覺到皮膚干燥、發(fā)癢、眼睛干澀充血和眼睛疼痛。

本研究組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過10周（約兩個(gè)半月）的游泳訓(xùn)練后，實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠的肺未見有器質(zhì)性病變，只是大部分大鼠肺泡壁出現(xiàn)了毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔可見有水腫液，但是這種現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)組與對照組均存在，兩組之間沒有明顯的差異?？梢?，按國家標(biāo)準(zhǔn)對游泳池水進(jìn)行氯化消毒并不會引起肺出現(xiàn)器質(zhì)性病變，肺泡壁毛細(xì)血管充血和肺泡腔內(nèi)的水腫液可能是因?yàn)榇笫笤谟斡居?xùn)練中，尤其是游泳能力測試過程中（要求游至力竭）嗆水過多所引起，休息一段時(shí)間應(yīng)該就能自行康復(fù)。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了10周，游泳池水氯化消毒更長期的影響還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4.2 氯化消毒游泳池水對訓(xùn)練效果影響的代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)（metabonomics）是新近發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，它研究的是生物體代謝產(chǎn)物的綜合組成以及機(jī)體在內(nèi)外刺激條件下的代謝反應(yīng)［26］。目前，代謝組學(xué)的研究正處于高速發(fā)展的階段，其應(yīng)用已經(jīng)波及到基礎(chǔ)生命科學(xué)、藥物研發(fā)、疾病生理等諸多方面，尤其是在環(huán)境毒理學(xué)研究領(lǐng)域，由于代謝組學(xué)具有整體性強(qiáng)（信息量大）、靈敏性高、時(shí)效性好等優(yōu)點(diǎn)，許多傳統(tǒng)生物學(xué)方法難以觀察到的毒理學(xué)現(xiàn)象或毒理學(xué)變化都可以借助于這一技術(shù)平臺進(jìn)行觀察與研究［3］。

4.2.1 氯化消毒游泳池水與大鼠代謝表型特征圖譜

代謝組學(xué)利用反映整體的代謝物圖譜直接認(rèn)識生物體的生理和生化狀態(tài)［6］，模式識別的結(jié)果（圖2）證明，經(jīng)過10周游泳訓(xùn)練后，實(shí)驗(yàn)組大鼠1H NMR代謝指紋圖譜與對照組相比出現(xiàn)了明顯的、有群體性特征的變化。這意味著實(shí)驗(yàn)組大鼠的代謝表型發(fā)生了特征性的變化，并且這種變化可能與大鼠的游泳訓(xùn)練效果有關(guān)。

4.2.2 相關(guān)代謝標(biāo)志物與耐力游泳能力

經(jīng)過對1H NMR譜上眾多的共振峰進(jìn)行重要性分析和譜峰歸屬（圖3），本研究發(fā)現(xiàn)，10周氯化消毒游泳池水游泳訓(xùn)練所引起的代謝表型變化的主要代謝標(biāo)志物為γ-氨基丁酸、丙酮酸和馬尿酸，并且實(shí)驗(yàn)組大鼠尿液中馬尿酸的相對含量較高，而γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量則較低。尿液1H NMR譜上反映的代謝物種類成千上萬，但是具有顯著性差異的代謝物卻非常少，如果沒有系統(tǒng)生物學(xué)的整體分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)這些代謝標(biāo)志物幾乎是不可能的。

研究表明，馬尿酸（Hippurate）在肝臟中的線粒體合成，它的合成依賴于線粒體氧化磷酸化提供三磷酸腺苷（ATP）的能力［18］，因此，尿液中馬尿酸的含量反映了肝細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)［2，12］。臨床上，馬尿酸檢驗(yàn)是肝功能測試指標(biāo)之一，它的主要作用是測知肝臟的解毒能力［10］，在職業(yè)醫(yī)學(xué)中和環(huán)境毒理研究中也常常測定尿液中的馬尿酸來反映環(huán)境污染的程度［14］。本研究中，實(shí)驗(yàn)組大鼠尿液中馬尿酸相對含量較高，這反映了它們的肝臟代謝活動較強(qiáng)。從這一現(xiàn)象，結(jié)合組織病理學(xué)檢測結(jié)果分析，10周氯化消毒水游泳訓(xùn)練沒有引起大鼠肝功能的損害，反而在氯化消毒副產(chǎn)物的刺激下，肝臟機(jī)能表現(xiàn)較為亢進(jìn)。肝臟是人體最重要的代謝器官：我們的心臟能夠有力和有規(guī)律地跳動；我們吃的食物能夠完全被消化和吸收；我們的大小腦，能夠保持正常的功能，我們的肌肉能夠保持結(jié)實(shí)和富有彈性—這一切都依靠著肝臟，肝臟解毒機(jī)能長期處于亢奮狀態(tài)可能也會影響到游泳訓(xùn)練的效果。

尿液中γ-氨基丁酸和丙酮酸的相關(guān)研究目前還不多，它們與運(yùn)動能力或者訓(xùn)練效果關(guān)系的直接研究更未見有報(bào)道出現(xiàn)，但是相關(guān)文獻(xiàn)早已證明了尿液中γ-氨基丁酸和丙酮酸的存在［8，22，23］。γ-氨基丁酸是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它的上升是引起運(yùn)動性疲勞的重要因素之一［15］；丙酮酸則位于無氧氧化供能和有氧氧化供能的交界點(diǎn)上，是生物體基本代謝極為重要的中間產(chǎn)物，它在無氧條件下產(chǎn)生乳酸，以糖酵解的形式供能，在有氧條件下，通過三羧酸循環(huán)完全氧化供能，同時(shí)，丙酮酸還可通過乙酰CoA和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化［1］。因此，實(shí)驗(yàn)組大鼠尿液γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量較低可能意味著它們的能量產(chǎn)生機(jī)制和清除γ-氨基丁酸的能力受到了損害，從而導(dǎo)致它們游泳訓(xùn)練效果下降和測試成績較差。

5 結(jié)論

按標(biāo)準(zhǔn)劑量對游泳池水投放含氯消毒劑進(jìn)行氯化消毒沒有引起受訓(xùn)大鼠的肺出現(xiàn)器質(zhì)性病變，但是對耐力游泳訓(xùn)練效果有一定的不良影響，氯化消毒副產(chǎn)物誘發(fā)的肝臟解毒功能亢奮和機(jī)體代謝表型的變化可能是這一影響產(chǎn)生的主要原因。

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