游泳池水氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果影響的組織病理學(xué)與代謝組學(xué)研究

李江華，王智慧，朱小娟，葛耀軍

1 前言

由于使用和投加方便，價格低廉，氯化消毒一直是游泳池水處理的主要方式。然而研究表明，傳統(tǒng)的含氯消毒劑，如液氯、漂白粉（次氯酸鈣）等，在殺死水中致病微生物的同時，又與水中的其他化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成了各種新的毒性物質(zhì)，統(tǒng)稱為氯化消毒副產(chǎn)物［17］。游泳池水質(zhì)問題，近年來在西方發(fā)達國家已經(jīng)引起了高度重視，目前，美國、澳大利亞等游泳強國已基本淘汰了舊的氯化消毒方式，被稱為第四代殺菌消毒劑的二氧化氯已經(jīng)成為游泳池水處理的主要方式，國際泳聯(lián)（FINA）制定的游泳池水質(zhì)衛(wèi)生標準也已經(jīng)對某些氯化消毒副產(chǎn)物的含量做出了明確的規(guī)定［16］。在國內(nèi)，雖然毒性及危險性極大的液氯也已經(jīng)逐步退出游泳池水處理市場，但是投放次氯酸鈣仍然是游泳池水處理的主要方式。據(jù)報道，長期在傳統(tǒng)氯化消毒游泳池水中游泳可能導(dǎo)致呼吸功能受損，患哮喘的幾率顯著提高［17］。至于傳統(tǒng)的氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果的影響，目前鮮見有相關(guān)的報道，我國與游泳強國游泳水平的差距是否與游泳池水質(zhì)有關(guān)也不清楚。進行本項目的研究，一方面，可以了解傳統(tǒng)氯化消毒對游泳訓(xùn)練效果的影響，為游泳項目訓(xùn)練提供科學(xué)依據(jù)；另一方面，利用組織病理學(xué)和基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)方法進行分析，對這種影響產(chǎn)生的原因及其生理、生化機制進行研究，為發(fā)展相應(yīng)的預(yù)防方法或措施提供理論支持。

2 研究對象與方法

2.1 研究對象

3周齡健康雄性SD大鼠12只，由南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供，清潔級實驗動物。平均體重207.1±43.9g，采用國家標準大鼠飼料分籠喂養(yǎng)（飼料由南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供），自由飲食，室溫20℃～24℃，自然光照。

2.2 分組與訓(xùn)練

12只SD大鼠隨機分為對照組（C組）與實驗組（E組），每組各6只，分別進行為期10周的漸增負荷游泳訓(xùn)練。實驗組游泳池水按照普通游泳池水質(zhì)標準投入次氯酸鈣，使余氯量達到國家標準（0.3～0.5mg/L）；對照組游泳池水為經(jīng)過美的凈水機過濾后的自來水，不添加任何消毒劑。每周訓(xùn)練5天，每天1次，每次訓(xùn)練持續(xù)時間以大鼠個體是否出現(xiàn)疲勞為準。負重量：正式訓(xùn)練第1周負重量為大鼠平均體重的2％，以后每2周在原有基礎(chǔ)上增加1％，一直增加至大鼠平均體重的5％為止；疲勞標準：大鼠鼻尖2次沉于水中5s以上，判斷為疲勞［7］，出現(xiàn)疲勞的大鼠停止訓(xùn)練，并及時撈出。

2.3 游泳測試與取樣

10周訓(xùn)練結(jié)束后，首先利用代謝籠收集尿樣（24h），EP管密封，-80℃冰箱保存，以備一維核磁共振氫譜（1H NMR）測試與代謝組學(xué)分析。尿樣收集完后，進行負重耐力游泳能力測試：測試時統(tǒng)一使用自來水為游泳用水，負重量約為平均體重的5％，入水開始計時，游至力竭停止計時，分別記錄每只大鼠游泳至力竭的時間。力竭標準：大鼠水中旋轉(zhuǎn)、運動協(xié)調(diào)性明顯下降，水淹沒鼻尖，身體下沉至水面超過10s［27］。負重耐力游泳能力測試完成后，大鼠休息2天（48h），斷頭處死，取肺臟進行組織病理切片。

2.41H NMR測試與組織病理切片

尿樣于室溫下解凍，每個尿液樣品取400μl，加入200μl磷酸緩沖液（0.3M，pH7.4），10％重水（D2O，鎖場），0.05％TSP（內(nèi)標）。靜置10min，再于4℃、13 000g離心10min，取上清入5mm核磁管進行1H NMR測量，磁場共振頻率400.13MHz，譜寬16.02ppm，掃描次數(shù)32，溫度30℃，預(yù)飽和方式壓水峰，脈沖序列NOESYPR1D。

從肺的同一部位切一小塊，4％的多聚甲醛緩沖固定液中固定12h，常規(guī)組織病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.51H NMR代謝組學(xué)分析

與傳統(tǒng)生物學(xué)將生命現(xiàn)象與少數(shù)幾個生物學(xué)指標進行相關(guān)研究的方法相反，代謝組學(xué)利用整體的分析方法對生命系統(tǒng)進行研究，通過測量樣本中的所有的代謝產(chǎn)物來反映生物體對不同刺激的反應(yīng)［3］。由于哺乳動物的代謝產(chǎn)物主要通過尿液排出，基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)研究通常以尿液作為研究對象，利用1H NMR產(chǎn)生數(shù)據(jù)。氫原子在不同分子中的化學(xué)環(huán)境不同，在1H NMR中顯示出不同的吸收峰，其中峰的數(shù)量就是氫的化學(xué)環(huán)境的數(shù)量，而峰的強度（也稱為面積），就對應(yīng)處于某種化學(xué)環(huán)境中的氫原子的數(shù)量。由于尿液1H NMR完整地反映了該實驗對象的代謝表型與代謝特征，被稱為“代謝指紋圖譜”。簡而言之，尿液1H NMR上不同的譜峰代表了尿液中不同的代謝物，譜峰的面積則反映了該代謝物的相對濃度；哺乳動物的代謝產(chǎn)物基本上都包含氫，而NMR是目前惟一既能定性又能在微摩爾范圍對所有含氫代謝物同時進行定量分析的技術(shù)［13］。

2.5.1 譜圖處理與產(chǎn)生數(shù)據(jù)

Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China.

利用軟件MestReC4.9.9.6對所測得的1H NMR進行手動相位和基線校正，以TSP共振峰為參考調(diào)零。然后對10～0.04ppm進行分段積分，每段0.04ppm，為了消除核磁共振采集信號過程中壓水峰所造成的影響，去除了水峰和尿素峰附近6.2～4.4ppm這一區(qū)段。結(jié)果從每張氫譜獲得了204個相應(yīng)的積分數(shù)據(jù)。在模式識別和進行數(shù)理統(tǒng)計與分析前，每段的積分數(shù)據(jù)相對于每張氫譜的總積分進行標準化處理［5］。

2.5.2 模式識別

哺乳動物尿液中的代謝物組成復(fù)雜，眾多的小分子代謝物通常會在1H NMR產(chǎn)生成千上萬的共振峰［19］，要想解讀如此復(fù)雜的信息，就必須借助以計算機信息技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的模式識別技術(shù)［9］。偏最小二乘法（PLS）是一種集多元線性回歸法和主成分分析（PCA）的基本功能于一體的、對高維度數(shù)據(jù)具有強大的處理能力的模式識別方法［4］。本研究采用SIMCA-P 10.0軟件包（瑞典，Umetrics-AB，Umea）進行PLS模式識別和自變量因子重要性程度分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 耐力游泳測試成績

實驗組大鼠游泳至力竭的時間為28.97±2.55min，對照組游泳至力竭的時間為39.15±9.85min，使用氯化消毒水進行游泳訓(xùn)練的實驗組明顯低于對照組，結(jié)果具有顯著性意義（P＜0.05）。

3.2 組織病理學(xué)檢測

大體解剖可見，大鼠肺的顏色和大小均正常，未見有明顯滲出、增生、水腫、萎縮等病變。切片鏡下觀察顯示，無論是實驗組還是對照組，大部分大鼠肺泡壁出現(xiàn)了毛細血管擴張充血，肺泡腔可見有水腫液（圖1），但是沒有發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性病變跡象，實驗組和對照組檢測結(jié)果基本一致，沒有明顯差異。

圖1 大鼠肺組織電鏡圖（HE×100）

3.3 代謝組學(xué)

3.3.1 模式識別結(jié)果

PLS模式識別結(jié)果如圖2所示，在以第一主成分（t1）為橫坐標，第二主成分（t2）為縱坐標的散點圖上，實驗組和對照組樣本被明確地分開了，而同組的樣本則各自聚集。這一結(jié)果表明，經(jīng)過10周的漸增負荷游泳訓(xùn)練后，實驗組大鼠代謝表型（1H NMR代謝指紋圖譜）與對照組相比出現(xiàn)了明顯的、有群體性特征的變化。

圖2 偏最小二乘法（PLS）模式識別效果圖（t1vs.t2）

3.3.21H NMR譜峰重要性分析與代謝標志物的發(fā)現(xiàn)

代謝組學(xué)通過代謝指紋圖譜來對生命系統(tǒng)進行研究，1H NMR譜上成千上萬的共振峰代表著不同的代謝物，但是這些代謝物在樣本分類中的重要性并不相同，許多譜峰強度的組間差異很小，在分類中的作用甚至接近于零。如圖2所示，PLS分析通過提取主成分t1和t2達到了降維的目的，使得實驗組和對照組樣本在二維圖上出現(xiàn)了明顯的類聚現(xiàn)象，但是哪些代謝物在樣本分類中起主要作用？或者說主要是哪些代謝物的共振峰使得實驗組和對照組的樣本出現(xiàn)了圖2中的類聚現(xiàn)象？PLS分析在實現(xiàn)降維的同時，還能對自變量因子的重要性進行分析，即1H NMR譜上某一化學(xué)位移區(qū)段上譜峰的重要性程度可以用變量投影重要性指標（variable importance in projection，VIP）來量化［4］，據(jù)此可以發(fā)現(xiàn)組間差異大、在樣本分類中的重要性也高的譜峰及其所代表的代謝物。本研究中，VIP值較高的前3個、能較大程度反映實驗組大鼠與對照組大鼠代謝表型差異的1H NMR譜區(qū)段依次為1.92～1.88ppm（VIP：2.62）、2.40～2.36ppm（VIP：2.45）4.00～3.96ppm（VIP：2.29）。譜峰歸屬結(jié)果如圖3所示，可見10周氯化消毒游泳池水游泳訓(xùn)練所引起的代謝表型變化的主要代謝標志物為：γ-氨基丁酸、丙酮酸和馬尿酸。

圖3 一維核磁共振氫譜（1H NMR）重要區(qū)段代表性的代謝標志物圖

3.3.3 實驗組與對照組代謝標志物相對含量的比較

VIP值較高的前3個1H NMR譜區(qū)段相對積分值比較結(jié)果如圖4所示，實驗組大鼠的4.00～3.96ppm區(qū)段明顯高于對照組，而在1.92～1.88ppm和2.40～2.36ppm這2個區(qū)段的相對積分值則明顯低對照組，差異均具有非常顯著性意義。由于每段1H NMR譜相對積分值在一定程度上反映該區(qū)段主要物質(zhì)的相對濃度，結(jié)合圖3譜峰歸屬的結(jié)果可以得出：實驗大鼠尿液中馬尿酸的相對含量較高，而γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量則較低。

圖4 重要的3個1H NMR譜區(qū)段相對積分值比較示意圖

4 討論

4.1 游泳池水氯化消毒的副作用的組織病理學(xué)分析

流行病學(xué)調(diào)查顯示，游泳池水氯化消毒對人體健康的危害主要體現(xiàn)在肺功能受損和引起哮喘。有研究顯示，經(jīng)常在氯化消毒游泳池中游泳，會導(dǎo)致肺上皮細胞滲透性增加［20］，有引起哮喘和其他呼吸性疾病的危險［24］。Thickett等人［28］通過對救生員和游泳教練的研究發(fā)現(xiàn)，空氣中的三氯化氮（一種氯化消毒副產(chǎn)物，Ncl3）濃度達到100～570mg/m3就可能引起職業(yè)性的哮喘。當(dāng)然，除哮喘以外，游泳池水氯化消毒副產(chǎn)物可能還與多種身體不適反應(yīng)有關(guān)［21］：研究顯示，Ncl3可能對救生員與游泳者的眼睛和上呼吸道具有強烈的刺激作用，Nystad等人［25］發(fā)現(xiàn)，游泳池游泳可引起幼兒呼吸道和耳朵感染反復(fù)發(fā)作；王春［11］曾對北京的部分游泳人群進行過問卷調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示，43.3％的人在游泳后感覺到皮膚干燥、發(fā)癢、眼睛干澀充血和眼睛疼痛。

本研究組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過10周（約兩個半月）的游泳訓(xùn)練后，實驗組和對照組大鼠的肺未見有器質(zhì)性病變，只是大部分大鼠肺泡壁出現(xiàn)了毛細血管擴張充血，肺泡腔可見有水腫液，但是這種現(xiàn)象在實驗組與對照組均存在，兩組之間沒有明顯的差異?？梢姡磭覙藴蕦τ斡境厮M行氯化消毒并不會引起肺出現(xiàn)器質(zhì)性病變，肺泡壁毛細血管充血和肺泡腔內(nèi)的水腫液可能是因為大鼠在游泳訓(xùn)練中，尤其是游泳能力測試過程中（要求游至力竭）嗆水過多所引起，休息一段時間應(yīng)該就能自行康復(fù)。當(dāng)然，本實驗只進行了10周，游泳池水氯化消毒更長期的影響還有待于進一步實驗驗證。

4.2 氯化消毒游泳池水對訓(xùn)練效果影響的代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)（metabonomics）是新近發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，它研究的是生物體代謝產(chǎn)物的綜合組成以及機體在內(nèi)外刺激條件下的代謝反應(yīng)［26］。目前，代謝組學(xué)的研究正處于高速發(fā)展的階段，其應(yīng)用已經(jīng)波及到基礎(chǔ)生命科學(xué)、藥物研發(fā)、疾病生理等諸多方面，尤其是在環(huán)境毒理學(xué)研究領(lǐng)域，由于代謝組學(xué)具有整體性強（信息量大）、靈敏性高、時效性好等優(yōu)點，許多傳統(tǒng)生物學(xué)方法難以觀察到的毒理學(xué)現(xiàn)象或毒理學(xué)變化都可以借助于這一技術(shù)平臺進行觀察與研究［3］。

4.2.1 氯化消毒游泳池水與大鼠代謝表型特征圖譜

代謝組學(xué)利用反映整體的代謝物圖譜直接認識生物體的生理和生化狀態(tài)［6］，模式識別的結(jié)果（圖2）證明，經(jīng)過10周游泳訓(xùn)練后，實驗組大鼠1H NMR代謝指紋圖譜與對照組相比出現(xiàn)了明顯的、有群體性特征的變化。這意味著實驗組大鼠的代謝表型發(fā)生了特征性的變化，并且這種變化可能與大鼠的游泳訓(xùn)練效果有關(guān)。

4.2.2 相關(guān)代謝標志物與耐力游泳能力

經(jīng)過對1H NMR譜上眾多的共振峰進行重要性分析和譜峰歸屬（圖3），本研究發(fā)現(xiàn)，10周氯化消毒游泳池水游泳訓(xùn)練所引起的代謝表型變化的主要代謝標志物為γ-氨基丁酸、丙酮酸和馬尿酸，并且實驗組大鼠尿液中馬尿酸的相對含量較高，而γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量則較低。尿液1H NMR譜上反映的代謝物種類成千上萬，但是具有顯著性差異的代謝物卻非常少，如果沒有系統(tǒng)生物學(xué)的整體分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)這些代謝標志物幾乎是不可能的。

研究表明，馬尿酸（Hippurate）在肝臟中的線粒體合成，它的合成依賴于線粒體氧化磷酸化提供三磷酸腺苷（ATP）的能力［18］，因此，尿液中馬尿酸的含量反映了肝細胞的機能狀態(tài)［2，12］。臨床上，馬尿酸檢驗是肝功能測試指標之一，它的主要作用是測知肝臟的解毒能力［10］，在職業(yè)醫(yī)學(xué)中和環(huán)境毒理研究中也常常測定尿液中的馬尿酸來反映環(huán)境污染的程度［14］。本研究中，實驗組大鼠尿液中馬尿酸相對含量較高，這反映了它們的肝臟代謝活動較強。從這一現(xiàn)象，結(jié)合組織病理學(xué)檢測結(jié)果分析，10周氯化消毒水游泳訓(xùn)練沒有引起大鼠肝功能的損害，反而在氯化消毒副產(chǎn)物的刺激下，肝臟機能表現(xiàn)較為亢進。肝臟是人體最重要的代謝器官：我們的心臟能夠有力和有規(guī)律地跳動；我們吃的食物能夠完全被消化和吸收；我們的大小腦，能夠保持正常的功能，我們的肌肉能夠保持結(jié)實和富有彈性—這一切都依靠著肝臟，肝臟解毒機能長期處于亢奮狀態(tài)可能也會影響到游泳訓(xùn)練的效果。

尿液中γ-氨基丁酸和丙酮酸的相關(guān)研究目前還不多，它們與運動能力或者訓(xùn)練效果關(guān)系的直接研究更未見有報道出現(xiàn)，但是相關(guān)文獻早已證明了尿液中γ-氨基丁酸和丙酮酸的存在［8，22，23］。γ-氨基丁酸是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它的上升是引起運動性疲勞的重要因素之一［15］；丙酮酸則位于無氧氧化供能和有氧氧化供能的交界點上，是生物體基本代謝極為重要的中間產(chǎn)物，它在無氧條件下產(chǎn)生乳酸，以糖酵解的形式供能，在有氧條件下，通過三羧酸循環(huán)完全氧化供能，同時，丙酮酸還可通過乙酰CoA和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化［1］。因此，實驗組大鼠尿液γ-氨基丁酸、丙酮酸的相對含量較低可能意味著它們的能量產(chǎn)生機制和清除γ-氨基丁酸的能力受到了損害，從而導(dǎo)致它們游泳訓(xùn)練效果下降和測試成績較差。

5 結(jié)論

按標準劑量對游泳池水投放含氯消毒劑進行氯化消毒沒有引起受訓(xùn)大鼠的肺出現(xiàn)器質(zhì)性病變，但是對耐力游泳訓(xùn)練效果有一定的不良影響，氯化消毒副產(chǎn)物誘發(fā)的肝臟解毒功能亢奮和機體代謝表型的變化可能是這一影響產(chǎn)生的主要原因。

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