犬瘟熱病毒水貂株H與F蛋白基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

蘇鳳艷，溫鐵峰，宗 穎，王全凱

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118)

犬瘟熱(Canine distemper，CD)系由副粘病毒科麻疹病毒屬犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病.由于CDV呈世界性分布，自然感染宿主種類廣泛，且可在大量不相關(guān)的動物種類間交叉感染，因此，消滅CDV幾乎是不可能的［1］，但可以利用疫苗進(jìn)行人工主動免疫控制犬瘟熱.目前常用的犬瘟熱疫苗有CDV滅活疫苗、MV疫苗、CDV弱毒疫苗，但是CDV滅活疫苗和MV疫苗不能給動物提供持久的保護(hù)力，而CDV弱毒疫苗的穩(wěn)定性較差，接種后易受母源抗體的干擾，對某些免疫缺陷動物和野生動物不安全，具有散毒的危險［2-4］.特別是近年來研究表明CDV在不斷發(fā)生變異，具有基因多樣性［5］.現(xiàn)已證明，目前流行的野毒株與標(biāo)準(zhǔn)的Covac、OP等疫苗株的抗原性、致細(xì)胞病變(CPE)類型、毒力等生物學(xué)特性方面存在部分差異［2-3，6］.歐洲和日本等地區(qū)均有已免疫過的犬再次爆發(fā)犬瘟熱［1，3，7］的現(xiàn)象.所以研制新型、安全、高效的疫苗以及檢測犬瘟熱的特異性診斷試劑已成為控制水貂犬瘟熱的研究熱點［8-9］.CDV主要由6種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，其中附著蛋白或血凝蛋白(Attachment protein or Hemagglutinin protein，H)在吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中起重要作用，它介導(dǎo)融合蛋白(Fusion protein，F(xiàn))與細(xì)胞發(fā)生融合反應(yīng)，而F蛋白可介導(dǎo)囊膜與細(xì)胞膜囊合［10-11］，是感染性病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需的，是犬瘟熱病毒的主要保護(hù)性抗原.因此，本研究構(gòu)建了水貂源犬瘟熱病毒H和F蛋白基因原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸埃希菌Escherichia coli中進(jìn)行表達(dá)，對其反應(yīng)原性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究其作為疫苗候選分子的可能性奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和質(zhì)粒

CDV由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)動物基因工程實驗室利用Vero傳代細(xì)胞，從1只臨床疑似犬瘟熱的病死水貂肝臟中分離獲得，經(jīng)系統(tǒng)的病毒學(xué)鑒定后保存［12］;均 E.coli JM109 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院經(jīng)濟(jì)動物基因工程實驗室保存;pMD-18T克隆載體和pET28a(+)原核表達(dá)載體為TaKaRa公司產(chǎn)品.

1.2 工具酶、試劑和抗體

Bam HⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ、RT-PCR 試劑盒和核酸相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為TaKaRa公司產(chǎn)品;RNAgentsRTotal RNA Isolation System Kit為Promega公司產(chǎn)品;IPTG為Sigma公司產(chǎn)品;DNA凝膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA回收和純化試劑盒為杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PVDF轉(zhuǎn)移膜為Gleman公司產(chǎn)品.兔抗CDV陽性血清由吉林省左家特產(chǎn)研究所贈送.

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GeneBank中 Messling等［13］發(fā)表的 Onderstempoort疫苗株(AF378705)H基因序列和F基因序列，利用Gene runner軟件設(shè)計引物，預(yù)期擴(kuò)增的H基因和F基因片段長度分別為843和1 067 bp.H基因上游引物:5'-CGGATCCAGGATAATGCAAGAGCC-3';H基因下游引物:5'-GCTCGAGAAGCCAGTGTCAACTCAC-3'.F基因上游引物:5'-GGGTACCTCCAACCTCAATGCTCAAG-3';F基因下游引物:5'-CGGATCCAGAGCGCCTAACCGTCTC-3'.

在H基因上、下游引物5'端分別引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點.在F基因上、下游引物5'端分別引入KpnⅠ和Bam HⅠ酶切位點.引物由上海生物工程生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.4 CDV的增殖及RNA的提取

將長滿單層的非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，接種CDV水貂分離株，37℃感作1 h后，棄去病毒液.加入含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃條件培養(yǎng)72 h.按試劑盒說明提取CDV總RNA，-20℃條件保存.

1.5 CDV H和F蛋白基因的擴(kuò)增及純化

以犬瘟熱病毒RNA為模板，對H和F基因進(jìn)行擴(kuò)增.RT反應(yīng)總反應(yīng)體系為10.00μL:MgCl22.00 μL，10× RT 緩沖液 1.00 μL，ddH2O 0.75 μL，dNTP 1.00 μL，RNase抑制劑0.25 μL，AMV 0.50 μL ，下游引物0.50μL，模板RNA 4.00μL.反轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 20 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min.PCR反應(yīng)體系為50.00μL:5×PCR緩沖液10.00μL，Ex Taq E 0.25 μL，上游引物0.50 μL，ddH2O 34.25 μL，RT 產(chǎn)物5.00 μL.反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min;94℃熱變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并以DNA凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化.

1.6 重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-H和pMD-18T-F的構(gòu)建與鑒定

純化的PCR產(chǎn)物與pMD-18T simple vector于16℃連接8 h，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-F和pMD-18TH，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109.E.coli JM109感受態(tài)的制備(CaCl2法)和轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行.通過α-互補(bǔ)法挑取白色菌落，接種于含Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.堿裂解法小量提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切鑒定，選取陽性克隆送至大連寶生物公司測序.

1.7 原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F的構(gòu)建與鑒定

以Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-H和pET28a(+)載體，以KpnⅠ和Bam HⅠ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-F和pET28a(+)載體，切膠回收后，按照體積比(載體∶插入片段=1∶3)取適量線性化載體pET28a(+)和CDV H和F基因片段混勻，加入T4DNA連接酶于連接反應(yīng)體系中，16℃連接8 h，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB瓊脂平板.以堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定.

1.8 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta2(DE3)宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂于含Kan的LB瓊脂平板上，37℃條件培養(yǎng)過夜.

挑取單個轉(zhuǎn)化菌落接種于5 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min培養(yǎng)過夜.取2 mL接種于100 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 250 r/min培養(yǎng)至D600nm為0.6～0.8.加IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，37℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后5 h、誘導(dǎo)后10 h收集菌液.以同樣的方法誘導(dǎo)含空載體 pET28a(+)的 E.coli Rosetta2(DE3)10 h作對照.收集的菌液進(jìn)行SDSPAGE和Western-blot分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 CDV H和F蛋白基因的獲得

利用所設(shè)計的引物，采用RT-PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增出了840 bp左右的CDV H基因片段(圖1a)和1 060 bp左右的CDV F基因片段(圖1b)，與預(yù)期DNA片段大小相符.

圖1 分離株的H和F基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of H and F genes fragments from isolated strains

2.2 克隆質(zhì)粒的酶切鑒定

以KpnⅠ和Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒pMD-18T-F，得到約2 700 bp的pMD18-T線性片段和約1 000 bp的插入片段(圖2a).以Bam HⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒pMD-18T-H，得到約2 700 bp的pMD18-T線性片段和約850 bp的插入片段(圖2b).序列分析結(jié)果表明，成功地克隆了CDV H蛋白基因和F蛋白基因.

圖2 pMD-18T-F和pMD-18T-H的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Restriction endonudeases analysis of pMD-18T-F and pMD-18TH

2.3 原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F的酶切鑒定

對pET28a-H和pET28a-F質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后，得到了約5 400 bp的pET-28a(+)的線性片段及約850和1 000 bp的插入片段(圖3).說明成功地構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F.

圖3 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Analysis of recombinant prokaryotic expression plasmids by restriction enzyme cleavge

2.4 SDS-PAGE 分析

在E.coli BL21(DE3)中，重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H和pET28a-F由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中均表達(dá)融合蛋白，其相對分子質(zhì)量分別約為31 400和38 200，與預(yù)測大小相符(圖4).

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒在Escherichia coli BL21中的表達(dá)Fig.4 Recombinant expression plasmids expressed in E.coli BL21

2.5 W estern-blot分析

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以犬瘟熱多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗，聯(lián)苯胺(DAB)為底物，進(jìn)行蛋白印跡分析，結(jié)果如圖5，在相對分子質(zhì)量為31 400和38 200處分別有1條明顯的蛋白印跡帶，表明H和F蛋白基因片段經(jīng)原核表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物具有與CDV抗血清結(jié)合的反應(yīng)原性.

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析Fig.5 Western-blot analysis of expression products

3 討論

犬瘟熱在世界分布廣泛，不僅影響動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而且給經(jīng)濟(jì)貿(mào)易帶來了嚴(yán)重影響.因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法及研制更為安全有效的疫苗迫在眉睫.

CDV結(jié)構(gòu)蛋白中，F(xiàn)蛋白位于CDV囊膜上，呈纖突狀，是CDV病毒感染細(xì)胞所必須的成分，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要抗原，F(xiàn)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下可抑制癥狀的發(fā)生.而且該蛋白基因相對比較保守［14］，在診斷上亦具有一定的價值，其抗體可用于CDV感染的診斷或流行病學(xué)調(diào)查.CDV的H蛋白決定著病毒感染的趨向性和致細(xì)胞病變［15］，是決定融合效率的主要決定因子.

本試驗以CDV的H、F蛋白基因為研究對象，采用PET-28a原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了H蛋白和F蛋白.Western-blot檢測結(jié)果顯示，重組融合蛋白能夠被CDV陽性血清識別，而與陰性血清無反應(yīng)，表明重組融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為CDV ELISA檢測法包被抗原.該結(jié)果為下一步研究CDV基因結(jié)構(gòu)及其蛋白功能，以及利用所表達(dá)的蛋白研制基因工程亞單位疫苗等工作奠定了基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯 李曉卉】