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    產(chǎn)油微生物的篩選

    2012-03-05 06:50:38葉思特郭麗瓊劉曉蓉陳曉陽林俊芳
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)油初篩酵母菌

    葉思特,郭麗瓊,,劉曉蓉,,陳曉陽,林俊芳,

    (1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物質(zhì)能研究所,廣東廣州 510642)

    全球石化資源日益枯竭,國際油價強勢上漲,生態(tài)環(huán)境日漸惡化,多渠道開發(fā)可再生油脂資源受到重視.生物柴油是性能優(yōu)良、可直接替代化石柴油的生物燃料產(chǎn)品[1-2],其主要化學(xué)成分是長鏈脂肪酸(甲)酯.目前,大多以動植物油脂為原料經(jīng)過酯交換反應(yīng)來生產(chǎn).但由于動植物油脂資源非常有限,且原料成本極高,因而限制了生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.科研人員長期探索和研究發(fā)現(xiàn),少數(shù)微生物能將碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂在菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化為油脂,因此利用微生物生產(chǎn)油脂是一條開發(fā)新油源的好途徑[3-5].Ratledge 等[6]把油脂積累量超過細胞總量20%的微生物定義為產(chǎn)油微生物(Oleaginousmicro-organisms).已知的產(chǎn)油微生物包括細菌、酵母菌、霉菌和微藻[7],其中酵母菌和霉菌類真核微生物積累的油脂具有與常規(guī)植物油更相似的脂肪酸,如菜籽油、棕櫚油和大豆油等,并且富含飽和及低度不飽和的長鏈脂肪酸,是生產(chǎn)生物柴油的潛在原料.后來,關(guān)于微生物油脂的研究主要集中于獲取功能性油脂,如富含多不飽和脂肪酸的油脂[8].近來人們意識到通過微生物生產(chǎn)油脂及相關(guān)脂肪酸代謝衍生物,對生物柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生物質(zhì)資源利用具有重要意義[9].在國內(nèi)外眾多微生物發(fā)酵產(chǎn)油的研究中,粘紅酵母Rhodotorula glutinis所產(chǎn)油脂含量最高,達到72%[6];油脂含量超過25%的霉菌約有64種,很多霉菌油脂含量在20% ~25%[10].這些產(chǎn)油微生物發(fā)酵使用的碳源主要是葡萄糖、淀粉、甘油及谷類等,生產(chǎn)成本高.因此,針對生物柴油的微生物油脂生產(chǎn)技術(shù),需要研究來源廣泛、成分穩(wěn)定、價格低廉的油脂發(fā)酵原料.本試驗篩選到4株產(chǎn)油酵母和9株產(chǎn)油霉菌,并對其中1株酵母所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成進行了初步分析,以期為下一步產(chǎn)油工程菌株的構(gòu)建、廢棄木質(zhì)纖維素的高效利用、微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ).

    1 材料與方法

    1.1 土壤樣品

    泥土采自湛江、石油平臺污泥、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園、南京紫荊山、河南漯河、中山植物園.采集時,先用小鏟除去表土,取離地表5~15 cm處的泥土,裝入聚乙烯袋中,樣品保存于0℃的保溫瓶中備用.

    1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

    ①蘇丹黑B、甲醇、氯仿等試劑購自上?;瘜W(xué)試劑廠.②酵母富集培養(yǎng)基:甘油100 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,酵母粉0.2 g/L,pH 6.0~6.5,121℃滅菌20 min.③酵母篩選培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,酵母粉0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,瓊脂20 g/L,臨用前加入20 mL預(yù)先滅菌的去氧膽酸鈉溶液和3.3 mL鏈霉素溶液(10 000 U/mL),pH 6.0~6.5,121℃滅菌20 min.④酵母菌種保藏培養(yǎng)基:麥芽汁(10°Bx)100 mL,瓊脂2 g,pH自然(約6.4).⑤霉菌篩選培養(yǎng)基:采用PDA培養(yǎng)基,臨用前在1 000 mL無菌培養(yǎng)基中加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素.⑥產(chǎn)油微生物的初篩培養(yǎng)基采用限氮培養(yǎng)基:葡萄糖 40 g/L,(NH4)2SO42 g/L,KH2PO47 g/L,NaH2PO42 g/L,酵母粉 1 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L.

    1.3 產(chǎn)油酵母的篩選

    1.3.1 酵母的富集培養(yǎng) 取土壤樣品30份,每份稱取25 g,置于225 mL無菌生理鹽水中,充分振搖,制成土壤懸液;無菌操作,分別吸取10 mL溶液接入90 mL富集培養(yǎng)液中,28℃恒溫培養(yǎng)24 h后,分別吸取1 mL菌懸液轉(zhuǎn)接到99 mL新鮮富集培養(yǎng)液中,連續(xù)培養(yǎng)2~3代.

    1.3.2 酵母的分離純化 準確移取100μL培養(yǎng)了2~3代的富集培養(yǎng)液,涂布于酵母篩選培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2~4 d,挑取平板上菌落形態(tài)有差異的單菌落進行劃線分離純化,獲得的純菌株轉(zhuǎn)接到麥芽汁斜面,編號保存.

    1.3.3 產(chǎn)油酵母的初篩 將分離純化的酵母接入限氮培養(yǎng)基中,于28℃、180 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)3 d,取1滴菌液于載玻片上,涂片、加熱固定,用蘇丹黑B染色10~15 min后,傾去染料并用濾紙吸干,再用二甲苯?jīng)_洗至無色,最后用w為0.5%的沙黃復(fù)染1~2 min,水洗吸干.顯微鏡下觀察,脂類能被染成藍黑色[11].菌株用PDA斜面編號保存.

    1.4 產(chǎn)油霉菌的篩選

    1.4.1 霉菌的分離純化 取土壤樣品30份,每份取25 g加入225 mL無菌生理鹽水中,搖勻,制成土壤懸液;無菌吸取100μL接到平板上,28℃恒溫培養(yǎng)5~7 d后,挑取平板上菌落顏色有差異的單菌落進行劃線分離純化,獲得的純菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面,編號保存.

    1.4.2 產(chǎn)油霉菌的初篩 將分離純化的菌株接入限氮培養(yǎng)基中,于28℃、180 r/min的恒溫搖床上培養(yǎng)5 d,菌絲用濾紙過濾,輕壓風(fēng)干,浸泡于蘇丹黑B染液中10 min,再用φ為95%酒精漂洗,致使濾紙呈白色,觀察菌體,帶有藍黑色則含有脂質(zhì)物質(zhì)[12].菌種用PDA斜面編號保存.

    1.5 產(chǎn)油微生物的初步鑒定

    1.5.1 總DNA提取 參考王藝紅[13]的FEDB法.1.5.2 5.8S rDNA PCR擴增 分別使用ITS1、ITS4 2種通用引物進行PCR擴增,引物序列為:ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC.反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;按94℃ 40 s,53~49℃ 40 s,72℃ 90 s進行30次循環(huán);72℃ 7 min;4℃保存.PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定,得到的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上進行 blast,并使用遺傳進化樹做分析,從而初步鑒定菌株.

    1.6 油脂的提取

    1.6.1 酸熱法破碎細胞 產(chǎn)油微生物通過限氮培養(yǎng)法獲得的發(fā)酵液在常溫、5 000 r/min下離心6 min,收集菌體到50 mL離心管中.在離心管中加入4 mol/L的鹽酸10 mL,浸泡過夜,沸水浴15~20 min.1.6.2 甲醇-氯仿法抽提油脂 在酸熱法破碎所得液體冷卻后加入10 mL甲醇和10 mL氯仿,充分振蕩后離心,取氯仿層,加入等體積w為0.1%的氯化鈉溶液,混勻,離心,去氯仿層,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得油脂.

    1.6.3 產(chǎn)油率計算 產(chǎn)油率=油脂質(zhì)量/菌體干質(zhì)量×100%.

    1.7 油脂成分的分析

    選取產(chǎn)油率最高的菌株,采用限氮培養(yǎng)法,發(fā)酵液pH始終維持6.5,于28℃、180 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)7 d后,提取油脂.油脂先經(jīng)甲酯化前處理,再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)分析測定各成分及含量.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)油微生物的初篩

    2.1.1 產(chǎn)油酵母的粗篩 酵母菌經(jīng)過限氮培養(yǎng)后,取菌液進行蘇丹黑B染色并在顯微鏡下觀察,結(jié)果見圖1.酵母細胞內(nèi)呈現(xiàn)明顯的黑色斑,說明該酵母細胞已有脂肪積累.這是因為酵母積累油脂后其胞內(nèi)存在的脂肪體可被蘇丹黑B染色,在光學(xué)顯微鏡下可清晰地觀測到.根據(jù)這個原理可利用鏡檢法對酵母油脂積累表型進行快速初篩,本研究篩選出4株產(chǎn)油酵母,分別編號為 J2-2A、J2-2B、J3-2A、J3-2B.

    2.2 產(chǎn)油微生物的相似性比對

    圖1 J2-2A菌株細胞蘇丹黑B染色后的顯微照片F(xiàn)ig.1 Micrograph of yeast J2-2A stained by Sudan Black B

    2.1.2 產(chǎn)油霉菌的初篩 由于霉菌菌絲體發(fā)達,光學(xué)顯微鏡制片過程繁瑣,且不便于限氮發(fā)酵培養(yǎng),而濾紙能吸附受擠壓菌體的油脂,因而采用濾紙法對篩選霉菌菌絲進行蘇丹黑B染色,結(jié)果見圖2.

    圖2 M2B菌株細胞的蘇丹黑B染色圖Fig.2 Picture ofmould M2B stained by Sudan Black B

    菌體經(jīng)過蘇丹黑B染色后呈現(xiàn)藍黑色,油脂含量越多,染色越深,說明供試霉菌經(jīng)過限氮培養(yǎng)后菌絲細胞中有脂肪積累.依此法,本研究篩選獲得了9株產(chǎn)脂肪的霉菌,分別編號為 M1C、M2B、M2C、M2E、M3C、M4C、M5A、M5B、M5D.

    使用ITS(Internally transcribed spacer)法對產(chǎn)油微生物進行相似性比對,結(jié)果見表1.

    表1 產(chǎn)油酵母和產(chǎn)油霉菌相似性比對結(jié)果Tab.1 Results of oleaginous yeasts and oleaginousmoulds by blast

    2.3 產(chǎn)油率的測定

    把獲得的初篩菌株進一步經(jīng)過限氮擴大培養(yǎng),收集菌體并通過酸熱法、甲醇氯仿法抽提獲得油脂,計算其產(chǎn)油率,結(jié)果見表2.

    表2 產(chǎn)油酵母和產(chǎn)油霉菌的產(chǎn)油率Tab.2 Lipid yields of oleaginous yeasts and oleaginous moulds

    由表1可知,所有初篩的菌株均可產(chǎn)油,表明初篩方法準確可行.霉菌的產(chǎn)油率在17% ~27%,其中產(chǎn)油最高的菌株為M2B,產(chǎn)油率達到26.4%;酵母的產(chǎn)油率在17% ~45%,其中菌株J2-2B的產(chǎn)油率最高,達44.3%.所以選擇酵母菌株J2-2B用于后期發(fā)酵生產(chǎn)、油脂鑒定試驗.

    2.4 油脂成分的測定

    菌株J2-2B發(fā)酵所得油脂經(jīng)過GC-MS分析,其成分及質(zhì)量比見表3.

    表3 產(chǎn)油酵母J2-2B的油脂成分及質(zhì)量比分析Tab.3 Lipid analysis data of yeast J2-2B

    由表3可知,油脂的主要成分為C14~C20脂肪酸,其中C16脂肪酸(棕櫚酸)和C18脂肪酸(油酸)質(zhì)量比較高,分別為17.21%和54.04%.

    3 討論與結(jié)論

    目前關(guān)于產(chǎn)油微生物的篩選方法很多[4,14-15],但是實際操作復(fù)雜、繁瑣.本試驗研究出一套操作簡易、效果優(yōu)良的產(chǎn)油微生物篩選體系與方法:選用以甘油為唯一碳源的富集培養(yǎng),能有效排除雜菌、大量保留和富集酵母菌,再配合鏈霉素以及脫氧膽酸鈉的復(fù)合篩選,從而快速初篩出產(chǎn)油酵母;對于產(chǎn)油霉菌的篩選,采用濾紙碾壓的方法對霉菌染色,簡單、便捷而有效,避開了霉菌用光學(xué)顯微鏡觀察時制片過程中的繁雜手續(xù).

    本研究篩選出一株高油脂菌株假絲孢酵母,產(chǎn)油率高達44.3%;其他菌株的產(chǎn)油率大多為17%~27%,文獻報道的產(chǎn)油率大多為 20% ~25%[1,4],本試驗與前人研究結(jié)果基本一致.這為下一步高產(chǎn)油菌株的改造、產(chǎn)油發(fā)酵條件的研究提供了理論基礎(chǔ).

    劉淑君等[16]以廢糖液為碳源,用Lipomyces starkey發(fā)酵得菌體油脂質(zhì)量比為53.6%,其油脂的脂肪酸組成主要有軟脂酸、油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸.本試驗中,假絲孢酵母發(fā)酵所產(chǎn)的油脂成分與已報道的比較一致,即主要為C16和C18脂肪酸,其總質(zhì)量比占 70%以上,其中油酸質(zhì)量比最高,達54.04%;棕櫚酸次之,為17.21%.

    試驗過程中,產(chǎn)油微生物的細胞破碎-油脂提取采用酸熱法和甲醇氯仿法,此法具有操作簡單、細胞破碎完全、提取速度快、得油率高等優(yōu)點,但是一次性批量生產(chǎn)的量少,鹽酸、甲醇和氯仿等試劑的消耗量大,導(dǎo)致提取成本高、環(huán)境污染大,因此,提取工藝的改進還有待深入研究.

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    【責任編輯 李曉卉】

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