硫化氫對再生肝細(xì)胞Ras-ERK通路活化的影響

王新國 張思泉 劉華鋒

(杭州市第六人民醫(yī)院,浙江 杭州 310014)

目前,肝細(xì)胞生長因子(hepatic growth factor,HGF)因促進(jìn)成熟肝細(xì)胞增殖而用于重型肝炎的治療,取得良好效果。但HGF調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖需一氧化氮(NO)的介導(dǎo)[1],后者與硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)同為氣體調(diào)節(jié)分子,共同調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能[2]。然而,硫化氫對肝細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)尚不明確。本研究硫化氫對感染HBV肝細(xì)胞增殖的影響和相應(yīng)信號通路改變,為臨床治療慢性乙型重型肝炎提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月～2011年12月入住本院25例慢性乙型肝炎患者作為觀察對象。年齡 21～35歲;男 15例 ,女 10例;HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性,乙肝病毒載量 ＞104copies/mL,ALT、AST 50～150U/L,膽紅素 7.9～21μmol/L。

1.2 標(biāo)本的采集 在B超定位下,穿刺肝組織1.5～2.0cm,無菌注射器針頭從肝穿槍組織槽中截取組織0.8～1.0cm放入預(yù)冷(4℃)D-Hanks液中,10分鐘之內(nèi)進(jìn)行肝細(xì)胞分離。

1.3 肝臟細(xì)胞分離與凍存 首先用眼科剪剪碎肝組織至糊狀,然后用緩沖液充分清洗并加入0.05%的IV型膠原酶液進(jìn)行消化30分鐘,再用D-Hank’s液清洗,最后加入含有血清的RPMl 1640培養(yǎng)液終止胰酶的作用,得到消化徹底的細(xì)胞懸液。200目篩網(wǎng)過濾及低速離心純化肝細(xì)胞(800g5分鐘)。分離純化后的采用兩步法凍存。取無菌凍存管(2mL)1支將細(xì)胞用自制的凍存液(RPMI 1640+30%FBS+雙抗+0.1U/mL胰島素+2%DMSO)制成1×105/mL細(xì)胞懸液,置-20℃2小時(shí)后凍存于-70℃冰箱內(nèi)凍存。

1.4 硫化氫對肝細(xì)胞增殖的影響 為探討硫化氫對肝炎肝細(xì)胞增殖和通路影響,凍存肝細(xì)胞復(fù)蘇,培養(yǎng)24小時(shí)后,用臺盼蘭拒染色法評估細(xì)胞活性。并分成肝炎細(xì)胞組(C),肝炎細(xì)胞+HGF組,肝炎細(xì)胞+炔丙基甘氨酸(Propargylglycine,PPG;2mmol/L)+HGF組,肝炎肝細(xì)胞+NaHS(硫化氫供體,1mmol/L)+HGF組,調(diào)肝細(xì)胞濃度為5×103/mL,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,24小時(shí)測定MTT。PPG為胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)抑制劑。

1.5 硫化氫對肝細(xì)胞增殖的Ras-ERK通路的影響 上一步驟細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí),離心(800g 5分鐘),收集細(xì)胞,加蛋白上樣Buffer 300μL,超聲粉碎細(xì)胞(350焦耳5秒),煮沸5分鐘,冰上冷卻,上樣,PAGE電泳,PVDF膜印記,脫脂奶粉封閉1小時(shí),PRas、ERK(P-ERK)、β-actin 一抗 4℃冰箱孵育過夜,二抗室溫孵育1小時(shí),ECL顯色,曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)用(表示,兩組數(shù)據(jù)之間LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 肝細(xì)胞活性 細(xì)胞經(jīng)過凍存后復(fù)蘇,再培養(yǎng)24小時(shí),臺盼蘭拒染色實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活性＞90%,見圖1。

圖1 肝細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活力情況

2.2 細(xì)胞增殖情況 HGF組肝細(xì)胞吸光度值明顯增加：應(yīng)用CSE抑制劑 PPG減少內(nèi)源性硫化氫,肝細(xì)胞吸光度值增加更加明顯,細(xì)胞增殖亦明顯;加NaHS后,肝細(xì)胞吸光度值明顯減小。

圖2 各組肝細(xì)胞增殖情況

圖3 各組Ras-ERK的磷酸化情況

2.3 肝細(xì)胞Ras-ERK的磷酸化活化 HGF促肝細(xì)胞增殖時(shí),Ras-ERK磷酸化增強(qiáng);PPG抑制內(nèi)源性硫化氫時(shí),Ras-ERK磷酸化減弱,加用硫氫酸鈉后Ras-ERK磷酸化增強(qiáng)。

3 討 論

肝細(xì)胞再生是慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上重型肝炎(尤其中、晚期的患者)治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HGF因激活Ras-ERK通路[3],促肝細(xì)胞增生明確,被廣泛用于臨床。但是,應(yīng)用HGF治療后,患者死亡率仍居高不下[4],這與肝細(xì)胞再生的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜有關(guān)。

肝臟是硫化氫產(chǎn)生的主要器官,先后通過胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶催化L-半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫[5]。作者前期研究顯示,在肝炎和肝硬化形成和發(fā)展過程中,內(nèi)源性硫化氫發(fā)生改變;外加硫化氫供體和干擾內(nèi)源性硫化氫的產(chǎn)生均能改變肝病發(fā)展進(jìn)程[6-7],提示硫化氫調(diào)節(jié)肝病的發(fā)生和發(fā)展。本文用CSE抑制劑和硫化氫供體NaHS干預(yù)后,慢性乙型肝炎肝細(xì)胞的增殖功能發(fā)生明顯改變,再次體外證實(shí)硫化氫調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生增殖。

細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)機(jī)制和信號通路是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn),其中Ras/RAF/ERK途徑是肝細(xì)胞增殖的重要通路。為觀察硫化氫對此通路的作用,本研究應(yīng)用 HGF激活 Ras-ERK,觀察硫化氫對Ras、ERK磷酸化的影響。結(jié)果顯示硫化氫促進(jìn)Ras、ERK的活化磷酸化;利用CSE抑制劑 PPG后,ERK磷酸化減弱,這與文獻(xiàn)研究硫化氫對ERK的磷酸化作用相一致[8]。然而,通常Ras-ERK活化后細(xì)胞明顯增殖,而本實(shí)驗(yàn)則顯示增殖抑制,目前尚無確切的資料解釋此現(xiàn)象。這可能與其同時(shí)激活凋亡機(jī)制有關(guān),也可能與其激活P38MAPK有關(guān)[9]。

文獻(xiàn)報(bào)道硫化氫可以活化多種增殖信號通路[10],目前尚未明確硫化氫是否作用各種活化通路的共同靶點(diǎn)或機(jī)制。盡管如此,本研究表明硫化氫具有抑制肝細(xì)胞增殖功能和促進(jìn)Ras-ERK活化作用。

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