解決氧化還原酶反應(yīng)體系中輔酶問題的策略及其應(yīng)用

江金鵬，吳旭日，陳依軍

中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)研究室，江蘇 南京 210009

氧化還原酶是一類重要的生物催化劑。與化學(xué)催化劑相比，其催化的氧化還原反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性強(qiáng)、副反應(yīng)少和產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)，約占所有生物催化反應(yīng)的30%以上，并且隨著新酶的不斷發(fā)現(xiàn)和酶理性改造技術(shù)的發(fā)展，這一比例還在逐年升高[1-2]。雖然氧化還原酶能選擇性還原含羰基和醛類化合物為手性氨和手性醇[3-4]，并且這些產(chǎn)物可作為重要手性模塊在手性藥物制備、精細(xì)化工品生產(chǎn)及手性材料合成等多個領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，但是至今真正應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的案例卻屈指可數(shù)。其根本的制約因素在于：1) 氧化還原酶需要輔酶的參與，而這些輔酶大多為煙酰胺類，主要是NAD+/NADH和NADP+/NADPH；2) 在工業(yè)生物催化應(yīng)用中，通常需要人為添加外源性輔酶以完成催化反應(yīng)，而煙酰胺類輔酶價格昂貴、穩(wěn)定性差、難以重復(fù)利用，導(dǎo)致反應(yīng)成本高昂。因此，如何降低輔酶用量和成本成為氧化還原酶工業(yè)化應(yīng)用的一個重要課題。

經(jīng)過較長時間的研究，人們已建立了多種方法用于提高輔酶的利用效率，降低反應(yīng)中輔酶的成本，這些方法主要包括：采用酶法、電化學(xué)法、光化學(xué)法或化學(xué)法原位再生輔酶；利用代謝工程等手段改造細(xì)胞的代謝途徑，提高內(nèi)源性輔酶的含量和利用率；研究輔酶替代物等。這些策略都能夠不同程度地改善反應(yīng)體系中氧化還原酶的活性和輔酶的穩(wěn)定性，實現(xiàn)輔酶及其替代物的重復(fù)利用，提高氧化還原反應(yīng)的效率，降低生產(chǎn)成本，從而推動了氧化還原酶反應(yīng)體系的工業(yè)化進(jìn)程。

1 輔酶的體外循環(huán)再生

1.1 酶法循環(huán)再生

輔酶的酶法循環(huán)再生是指利用酶促反應(yīng)實現(xiàn)還原態(tài)或氧化態(tài)輔酶的重復(fù)利用。由于操作簡單可控、選擇性高、穩(wěn)定性好、再生體系與反應(yīng)體系兼容性強(qiáng)以及共底物價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是研究較多和使用較為廣泛的方法。根據(jù)實施策略的不同，酶法循環(huán)再生系統(tǒng)又分為兩類，第一類是底物偶聯(lián)法 (圖1)，即在反應(yīng)體系中僅有一種氧化還原酶，該酶既能催化共底物再生輔酶，又能利用輔酶和底物合成產(chǎn)物。目前最為常用的底物偶聯(lián)系統(tǒng)有異丙醇 (IPA)-NADPH循環(huán)系統(tǒng)和乙醇-NADH循環(huán)系統(tǒng)。例如，美國Codexis公司以IPA作為共底物構(gòu)建了IPA-NADPH輔酶再生體系，為氧化還原酶KRED催化合成抗哮喘藥物孟魯司特的手性醇中間體連續(xù)提供質(zhì)子供體，使底物完全轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的最大濃度達(dá)到100 g/L[5]。雖然底物偶聯(lián)法簡化了反應(yīng)體系并提高了輔酶的利用效率，但是該方法具有明顯的缺點(diǎn)：1) 僅利用一種酶在同一體系中催化兩個不同方向的反應(yīng)，因此較難獲得最適反應(yīng)的熱力學(xué)條件；2) 過量的共底物也會對酶產(chǎn)生抑制作用而降低催化效率。

另一類為酶偶聯(lián)法 (圖1)，即在一個反應(yīng)體系中聯(lián)合應(yīng)用兩種氧化還原酶催化不同反應(yīng)，一個酶催化底物反應(yīng)獲得產(chǎn)物，另一個酶催化共底物反應(yīng)實現(xiàn)輔酶再生。該方法由于具有共底物價廉、反應(yīng)的熱力學(xué)條件容易控制、輔酶再生效率高和循環(huán)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因此已成為應(yīng)用最為廣泛的輔酶再生技術(shù)。目前常用的酶偶聯(lián)輔酶循環(huán)系統(tǒng)有：甲酸-甲酸脫氫酶 (FDH) 系統(tǒng)、葡萄糖-葡萄糖脫氫酶 (GDH) 系統(tǒng)、6-磷酸葡萄糖-6-磷酸葡萄糖脫氫酶系統(tǒng)以及亞磷酸-亞磷酸脫氫酶 (PTDH) 系統(tǒng)。例如，本實驗室從不動桿菌Acinetobacter baylyi ATCC 33305克隆了一種新的氧化還原酶，命名為雙羰基還原酶(DKR)[6-7]，構(gòu)建了DKR和FDH的偶聯(lián)體系用于合成他汀類藥物手性二醇中間體。通過進(jìn)一步引入水-正己烷兩相系統(tǒng)，該偶聯(lián)體系的底物濃度提高至105 g/L[8]，較大地降低了生產(chǎn)成本。

圖1 輔酶的酶法循環(huán)再生Fig.1 Cofactor regeneration by enzymatic reactions. (A) Substrate coupling method. E: enzyme for catalyzing two different reactions in one system. (B) Enzyme coupling method. E1: product-preparing enzyme; E2: cofactor regeneration enzyme.

除了在反應(yīng)體系中添加氧化還原酶及相應(yīng)的底物進(jìn)行輔酶的循環(huán)再生外，利用微生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的氧化還原酶也能實現(xiàn)輔酶的循環(huán)再生。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)南極酵母 Rhodotorula sp. AS2.224細(xì)胞粗提液中含有內(nèi)源性甘露醇脫氫酶，并利用該酶再生NADPH，進(jìn)而輔助羰基還原酶催化底物2-乙?；拎さ倪€原，轉(zhuǎn)化率高達(dá)96.8%，ee值大于99%。最近，Yan等[10]構(gòu)建了羰基還原酶SCR1的大腸桿菌工程菌，證實了該菌的粗酶液中存在多種可用于NADPH再生的內(nèi)源性氧化還原酶。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后，含有羰基還原酶SCR1的粗酶液能催化80 mmol/L的α-羥基苯乙酮的還原，轉(zhuǎn)化率高達(dá)90.1%，ee值大于99%，NADPH的總轉(zhuǎn)化數(shù)為3 604。此外，本實驗室也考察了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)源性葡萄糖脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶再生輔酶的效率，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加葡萄糖能有效利用內(nèi)源性氧化還原酶和DKR形成的偶聯(lián)體系催化合成他汀類藥物手性二醇中間體，其催化效率與DKR-FDH偶聯(lián)反應(yīng)體系相當(dāng)[11]。這些實驗結(jié)果表明，利用微生物細(xì)胞自身的氧化還原酶來實現(xiàn)輔酶再生的方法不僅能夠降低生產(chǎn)成本，而且使實驗操作進(jìn)一步簡化，是一種有效的輔酶再生策略。但是，由于大多數(shù)天然存在的氧化還原酶存在表達(dá)量低、催化活性弱以及容易失活等缺點(diǎn)，其工業(yè)化應(yīng)用的潛力并不大。

1.2 電化學(xué)法、光化學(xué)法和化學(xué)法循環(huán)再生

電化學(xué)法是利用電極提供或接受電子使還原態(tài)或氧化態(tài)輔酶再生的方法。該方法雖然具有反應(yīng)體系簡單、不需外加第二個酶和共底物、成本低以及無副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，但也存在輔酶再生速率低、酶易失活、需要提供高電壓和電極易鈍化等諸多問題。盡管電極表面改性和新電子介體的尋找能夠在一定程度上解決上述問題，例如Kim等[12]制備的具有氧化還原性質(zhì)的氧化錫電極能夠有效再生輔酶，將其與醇脫氫酶偶聯(lián)可以用于合成丙酮，但電極材料本身的性能局限導(dǎo)致該方法目前尚處于實驗室研究階段，需要繼續(xù)發(fā)展和完善。

光化學(xué)法采用光敏染料 (如亞甲藍(lán)) 經(jīng)可見光照射激發(fā)后作為電子載體提供電子給氧化態(tài)輔酶而實現(xiàn)輔酶的再生。雖然該方法具有綠色環(huán)保、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但過于復(fù)雜的反應(yīng)體系和低下的輔酶再生效率致使其至今還停留在實驗室研究階段，離實際應(yīng)用還有一段距離。

輔酶的化學(xué)再生法就是利用化學(xué)電子供體如連二亞硫酸鹽將電子傳遞給氧化態(tài)的輔酶而實現(xiàn)NAD(P)H的再生。其中，利用廉價的氫氣以及性能優(yōu)良的釕復(fù)合物分別作為最終還原劑和催化劑還原氧化態(tài)輔酶是一種富有潛力的輔酶再生系統(tǒng)[13]。然而，該系統(tǒng)的輔酶再生效率偏低與穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)不利于工業(yè)化應(yīng)用，有待進(jìn)一步研究。

2 細(xì)胞代謝與內(nèi)源性輔酶

2.1 內(nèi)源性輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建

在不影響微生物細(xì)胞自身正常代謝的情況下，利用基因工程技術(shù)向細(xì)胞內(nèi)引入外源性氧化還原酶如GDH、PTDH和FDH，構(gòu)建胞內(nèi)輔酶再生系統(tǒng)以實現(xiàn)輔酶的循環(huán)利用是解決多酶、多底物輔酶再生系統(tǒng)兼容性和復(fù)雜性的有效手段。Berríos-Rivera等[14]將FDH引入大腸桿菌，加入甲酸后細(xì)胞內(nèi)NADH的含量增加了1倍，乙醇脫氫酶催化合成乙醇的效率也隨之提高了15倍。針對體外輔酶再生體系效率低、操作繁瑣與穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，本實驗室構(gòu)建了DKR和GDH的共表達(dá)重組大腸桿菌，通過酶催化反應(yīng)動力學(xué)分析和對工程菌細(xì)胞內(nèi)輔酶濃度的實時監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在全細(xì)胞催化反應(yīng)過程中，當(dāng)其他影響反應(yīng)效率的因素均相同時細(xì)胞內(nèi)輔酶濃度決定了全細(xì)胞的催化效率。在此規(guī)律指導(dǎo)下，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，在不需外加輔酶的情況下，利用以上共表達(dá)菌株催化底物完全轉(zhuǎn)化為合成他汀手性側(cè)鏈的中間體——3R,5S-雙羥基酯化合物，且反應(yīng)體系中底物濃度比單純表達(dá)dkr基因的細(xì)胞提高了15倍[15]，有效地解決了輔酶供應(yīng)這一制約因素，為氧化還原酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了新的思路。然而，該方法并不能提高細(xì)胞內(nèi)輔酶的總量，有時甚至需要添加外源性輔酶來增加細(xì)胞內(nèi)輔酶的濃度以加速催化反應(yīng)的完成。

2.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

由于培養(yǎng)基組分對微生物次生代謝途徑影響較大，因此優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，尤其是碳源，在一定程度上能直接調(diào)節(jié)氧化態(tài)和還原態(tài)輔酶的含量及其比例。San等[16]向培養(yǎng)基中添加多種氧化形態(tài)的碳源 (葡萄糖，山梨醇和葡萄糖酸)，發(fā)現(xiàn)不同碳源導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi) NADH/NAD+的比例產(chǎn)生較大差別，其原因在于不同氧化形態(tài)的碳源參與的糖酵解過程存在差異。此外，Liu等[17]在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 NAD+的生物合成前體煙酸 (NA) (圖2)，發(fā)現(xiàn)8 mg/L NA能夠有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NAD+的合成，從而增加了光滑球擬酵母Torulopsis glabrata細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物丙酮酸的濃度。

2.3 輔酶合成途徑的改造

微生物細(xì)胞內(nèi)的輔酶生成和降解始終處于一個動態(tài)的平衡過程，NAD (P) 的合成途徑主要分為從頭合成途徑 (De novo pathway) 和補(bǔ)救合成途徑 (Salvage pathway) (圖2)，其中改造補(bǔ)救途徑是增加內(nèi)源性輔酶總量的常用手段。煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (NAPRTase) 催化 NA磷酸化生成煙酸單核苷酸 (NAMN) 的反應(yīng)是補(bǔ)救途徑的限速步驟。據(jù)此，Witholts等[18]對NAPRTase的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并將其在大腸桿菌中過量表達(dá)，使內(nèi)源性煙酰胺輔酶的總量提高了5倍。Berrios-Rivera等[19]通過測定過量表達(dá)NAPRTase工程菌內(nèi)的煙酰胺輔酶的含量，同樣證實了高活力的 NAPRTase能夠促進(jìn)內(nèi)源性輔酶的合成，并且NADH/NAD+比例隨NAPRTase活性的增加而降低。

在輔酶的補(bǔ)救途徑中，NAD+激酶 (NADK)催化NAD+發(fā)生磷酸化即可生成NADP+[20-21]。Lee等[22]在胸苷生產(chǎn)菌中過量表達(dá)了NADK后，內(nèi)源性NADPH的含量增加到原先的1.3倍，胸苷的產(chǎn)率也隨之提高1.2倍。最近，另一新發(fā)現(xiàn)的NADK在構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans中被過量表達(dá)同樣能夠使內(nèi)源性NADPH總量得到明顯提高[23]。

圖2 輔酶的從頭合成途徑與補(bǔ)救途徑Fig. 2 Cofactor NAD (P) biosynthesis through the de novo pathway and salvage pathway. 1: quinolinic acid (QA) sythetase; 2: QA phosphoribosyltransferase; 3: nicotinic acid monocleotide (NAMN) adenylyltransferase; 4: NAD sythetase. NADK: NAD+ kinase; NAPRTase: nicotinic acid phosphoribosyltransferase; DHAP: dihydroxyacetone phosphate; IA: iminoaspartate; dNAD: desamido NAD; NA: nicotinic acid; NMN: nicotinamide mononucleotide.

2.4 輔酶再生代謝途徑的調(diào)控

細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)由眾多復(fù)雜的代謝途徑所構(gòu)成，通過對代謝網(wǎng)絡(luò)中輔酶再生和代謝途徑的調(diào)控可以改變內(nèi)源性輔酶的存在形態(tài)和利用度。例如磷酸戊糖途徑 (PPP) 是再生還原態(tài)輔酶NADPH的主要代謝途徑，Poulsen等[24]通過在黑曲霉Aspergillus niger內(nèi)過量表達(dá)PPP中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶，使內(nèi)源性NADPH的濃度增加了2至9倍。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH)是PPP途徑中另一種生成NADPH的關(guān)鍵酶，通過在大腸桿菌中過量表達(dá) G6PDH，可以使內(nèi)源性NADPH/NADP+的比例提高6倍[25]。

雖然通過對 PPP的改造可以有效增加內(nèi)源性NADPH的含量，但提高NADH的細(xì)胞內(nèi)濃度則需要修飾其他代謝途徑，如甲醇氧化途徑。Pscheidt等[26]系統(tǒng)分析了畢氏酵母 Pichia pastoris的甲醇氧化途徑中 3個關(guān)鍵酶 (乙醇氧化酶、甲醛脫氫酶 (FLD) 和FDH) 的動力學(xué)性質(zhì)，通過模擬和實驗發(fā)現(xiàn) FLD是該代謝途徑中NADH再生的主要限制酶。因此，在P. pastoris中過量表達(dá)FLD就可達(dá)到有效再生NADH的目的。此外，在厭氧發(fā)酵過程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原產(chǎn)生乳酸，同時消耗大量的NADH。為避免這一過程的發(fā)生，通過構(gòu)建過量表達(dá)甘油脫氫酶和丙酮醛合酶的乳酸脫氫酶缺陷型突變株，不僅增加了內(nèi)源性 NADH含量，而且利用該菌株催化合成 1,2-丙二醇的產(chǎn)率也提高了67%[27]。

雖然人們通過運(yùn)用各種策略使細(xì)胞的代謝流分布發(fā)生改變以達(dá)到提高內(nèi)源性輔酶總量并調(diào)節(jié)NAD (P)+/NAD (P) H比例的目的，但是由于細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，至今仍缺乏對輔酶相關(guān)代謝途徑的全面認(rèn)識，精確調(diào)控內(nèi)源性輔酶的含量及其形態(tài)還比較困難。因此，很有必要對胞內(nèi)輔酶的代謝情況進(jìn)行更深入的研究。最近，通過在大腸桿菌內(nèi)過量表達(dá)NAD (H) 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NTT4并敲除NAD+合成基因nadE，獲得了能直接利用細(xì)胞外NAD (H) 的NAD+營養(yǎng)缺陷型工程菌株，利用該菌株測定了大腸桿菌內(nèi)輔酶的濃度閾值[28]。這一研究結(jié)果進(jìn)一步加深了人們對細(xì)胞內(nèi)輔酶代謝情況的認(rèn)識，也將有助于對內(nèi)源性輔酶的含量和NAD (P)+/NAD (P) H比例進(jìn)行更精確的調(diào)控，為有效設(shè)計輔酶依賴型氧化還原酶介導(dǎo)的全細(xì)胞反應(yīng)體系提供了新的手段。

3 輔酶替代物的研究和應(yīng)用

針對天然輔酶穩(wěn)定性差、價格昂貴以及回收利用效率低等缺點(diǎn)，合成具有類似功能的替代物可能是解決輔酶現(xiàn)存問題的一條新途徑。

經(jīng)過長期的努力，人們已經(jīng)合成了眾多輔酶結(jié)構(gòu)類似物，希望從中篩選到理想的天然輔酶替代物。迄今，研究較多的是一類含有煙酰胺結(jié)構(gòu)的三嗪類染料，即活性藍(lán)2 (C.I. Reactive Blue 2，圖3)。由于該類染料能與氧化還原酶活性中心的輔酶結(jié)合位點(diǎn)相互作用，因此Burton等通過對眾多三嗪類染料的衍生物進(jìn)行篩選，獲得了具有天然輔酶活性的化合物活性藍(lán) N-3 (Blue N-3)[29](圖3)。但是，活性藍(lán)N-3結(jié)構(gòu)中的蒽醌生色團(tuán)在水溶液中的溶解度較差，并且因其在紫外-可見光范圍內(nèi)具有較大吸收而不利于用光譜法監(jiān)測反應(yīng)過程。為了解決這些問題，活性藍(lán)N-3中的蒽醌生色團(tuán)被替換成萘等基團(tuán)，由此合成了一系列活性藍(lán) N-3的衍生物[30-31]，并從中篩選到結(jié)構(gòu)簡單、水溶性高、穩(wěn)定性好以及紫外-可見光吸收值低的化合物CL4[32](圖3)，這使輔酶替代物研究又進(jìn)了一步。然而，與天然輔酶相比，這類替代物的催化活性仍然較低。因此，如何進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)，提高催化活性，減少反應(yīng)體系中的用量是該類輔酶替代物研究的重點(diǎn)。

圖3 NAD+，三嗪類染料活性藍(lán)2及輔酶替代物活性藍(lán)N-3，CL4的結(jié)構(gòu)式Fig. 3 Chemical structures of NAD+, triazine dyes C.I. Reactive Blue 2, Blue N-3 and CL4.

輔酶依賴型細(xì)胞色素P450具有重要的催化特性，因此針對該類酶催化的氧化還原反應(yīng)人們設(shè)計了多種輔酶替代體系[33-35]，其中采用含鈷的化合物 (Cobalt sepulchrate) (圖4) 作為輔酶替代物為細(xì)胞色素P450提供電子的體系最具代表性和最為典型[36]。Faulkner等[37]利用電化學(xué)法與cobalt sepulchrate偶聯(lián)為細(xì)胞色素P450連續(xù)提供電子，從而使P450催化月桂酸發(fā)生ω-羥化作用，并且反應(yīng)速率與NADPH介導(dǎo)的P450體系相當(dāng)。在此基礎(chǔ)上，為了改善水溶性和提高利用效率，Udit等[38]合成了親水性的NADPH替代物1,1’-二羧基二茂鈷 (圖4)。此外，為了進(jìn)一步簡化反應(yīng)體系和降低成本，Schwaneberg等用鋅粉作為電子供體構(gòu)建了zinc：cobalt (III) sepulchrate系統(tǒng)。將P450 BM-3與這一新系統(tǒng)偶聯(lián)，其催化合成對硝基苯酚的效率達(dá)到了NADPH反應(yīng)體系的20%[39]。雖然眾多研究表明，cobalt sepulchrate是一類較有潛力的輔酶替代物，但是反應(yīng)過程中產(chǎn)生的過氧化物以及體系中存在的氧氣會影響cobalt sepulchrate和P450的活性，因此需要進(jìn)一步研究對該體系進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 鈷復(fù)合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 4 Structures of cobalt complexes. (A) Cobalt sepulchrate. (B) 1,1’-dicarboxycobaltocene cation.

1-苯甲基-1,4-二氫煙酰胺是另一類重要的NAD+結(jié)構(gòu)類似物。將其與[Cp*Rh (bpy) (H2O)] (OTf)2偶聯(lián)，可以構(gòu)建輔酶替代物化學(xué)再生系統(tǒng)。Lo等[40]利用該系統(tǒng)輔助馬肝醇脫氫酶催化合成手性芳香和烷基取代醇，產(chǎn)率達(dá)到 90%，ee值大于90%。隨后，該系統(tǒng)被應(yīng)用于2-羥基-3-單加氧酶 (HbpA) 合成鄰苯二酚[41]以及P450突變體 (W1064S，R966D) 催化對硝基苯氧基癸酸的羥化反應(yīng)[42]。由此可見，1-苯甲基-1,4-二氫煙酰胺作為某些氧化還原酶的輔酶替代物進(jìn)行相應(yīng)的催化反應(yīng)具有良好的應(yīng)用前景。但是，該替代物仍然存在活性低和水溶性差等問題。因此，今后的工作還需集中在尋找新的輔酶結(jié)構(gòu)類似物，并對現(xiàn)有的輔酶替代物及與之匹配的氧化還原酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以改善現(xiàn)有替代物的各種缺陷。

4 總結(jié)與展望

雖然氧化還原酶展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景并在化學(xué)工業(yè)綠色化的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，但至今真正用于工業(yè)化生產(chǎn)的案例卻屈指可數(shù)。其根本的制約因素是：絕大多數(shù)氧化還原酶需在煙酰胺類輔酶的參與下才能完成催化反應(yīng)，而煙酰胺類輔酶價格昂貴、穩(wěn)定性差并且難以重復(fù)利用，造成催化反應(yīng)成本高昂。盡管近幾十年來人們針對輔酶問題已提出了多種解決方法，如構(gòu)建輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)、改造輔酶合成途徑、調(diào)控輔酶再生代謝途徑以及設(shè)計輔酶替代物等，并且取得了一些實質(zhì)性進(jìn)展，但是這些方法大多都存在各種各樣的問題和缺陷，嚴(yán)重阻礙了氧化還原酶在實際工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

基于輔酶工程的研究現(xiàn)狀和地球能源的逐漸枯竭以及人類環(huán)保意識的日益增強(qiáng)，采用理性設(shè)計或隨機(jī)篩選的方法獲得能夠直接利用水分子或氫氣作為電子供體完成氧化還原反應(yīng)的獨(dú)特氧化還原酶，以及研究和完善有效的輔酶供應(yīng)體系，將有可能從根本上解決輔酶問題，由此破解限制氧化還原酶工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸，進(jìn)一步擴(kuò)大氧化還原酶的應(yīng)用范圍，真正實現(xiàn)重要化學(xué)品的綠色化工業(yè)制造。

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