利用定點突變法研究精氨酸脫亞胺酶活性的影響機制

李利鋒，倪曄，孫志浩

江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

目前，肝癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)已經(jīng)成為世界范圍常見的惡性腫瘤之一。全球每年約有600 000名病人患有肝細(xì)胞癌。亞洲東部、東南部該病發(fā)病率為18.3%~35.5% (每10萬人)，而在中美洲該病發(fā)病率僅有2.1% (每10萬人)。肝癌患者在確診后沒有經(jīng)過治療其生存期平均為1~4個月[1]。通過手術(shù)治療HCC效果不佳，且術(shù)后易復(fù)發(fā)，因此臨床迫切需要一種治療肝癌的新方法[2-3]。研究中發(fā)現(xiàn)，ADI在體內(nèi)具有抑制精氨酸缺陷型腫瘤細(xì)胞的功效，且毒副作用較小[4]。ADI的抗癌機制是通過切斷精氨酸對腫瘤細(xì)胞的供給，從而消滅或控制精氨酸營養(yǎng)缺陷型癌細(xì)胞 (如：肝癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞等) 的生長。精氨酸對于人類是一種非必需氨基酸，正常細(xì)胞可經(jīng)尿素循環(huán)通過精氨酸-琥珀酸合成酶和精氨酸-琥珀酸裂解酶合成精氨酸[5-6]。

近年來，ADI作為新型抗癌藥物的臨床研究在國內(nèi)外已經(jīng)開展并引起了高度重視[7-10]，美國肯塔基大學(xué)和美國鳳凰生物科技公司對開發(fā)ADI作為抗癌藥物做了大量研究[11-12]。經(jīng) PEG修飾的支原體Mycoplasma來源的ADI重組蛋白ADI-PEG-20，即PEG化重組支原體ADI，于1999年和2005年分別被美國食品藥品管理局 (FDA)和歐洲藥品審評署 (EMEA) 批準(zhǔn)作為罕見病藥物用于治療惡性黑素瘤和 HCC。目前美國鳳凰生物科技公司的 ADI-PEG-20在美國進(jìn)行第 III期臨床實驗。在前期研究中，本研究室劉詠梅等在自然界篩選到產(chǎn) ADI的變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida，該ADI為同源二聚體，其最適pH為6.0，在人體生理pH (7.35~7.45)條件下的酶活力僅為最適條件下酶活力的 10%左右[13]；劉詠梅等在改良的二乙酰一肟瓜氨酸測定方法的基礎(chǔ)上，建立了高效靈敏的96孔板高通量篩選模型，采用易錯PCR法構(gòu)建ADI突變文庫，由 600多株突變株中篩選獲得了在生理pH條件下酶活力提高 20.5倍的 ADI突變株M314 (A128T/H404R/I410L)[14]。ADI突變株M314的最適pH為6.5，較野生型ADI的最適pH提高了0.5個單位，在生理pH條件下殘余酶活力為40%。為了進(jìn)一步探明M314中關(guān)鍵位點對精氨酸脫亞胺酶的影響，本研究采用定點突變法研究了精氨酸脫亞胺酶活性的影響機制。

定點突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間復(fù)雜關(guān)系的有效手段[15]。PCR介導(dǎo)的定點突變是目前廣為采用的方法之一[16]。目前，QuikChange PCR法 (快速定點突變法) 最為簡便快速，其原理為以環(huán)狀全質(zhì)粒為模板，使用兩條含突變位點的反向互補引物進(jìn)行 PCR擴增目的基因，其產(chǎn)物是含缺刻的環(huán)形質(zhì)粒，由于來源于大腸桿菌的模板質(zhì)粒幾乎全為甲基化的質(zhì)粒，因此，可以通過DpnⅠ限制性內(nèi)切酶降解模板質(zhì)粒，酶切后獲得的為含突變的質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌并修復(fù)環(huán)形缺刻最終獲得突變菌株[17]。ADI突變株M314較野生型ADI在生理pH條件下酶活力提高20.5倍，最適pH提高了0.5個單位。為進(jìn)一步了解M314中特定氨基酸位點對酶活力的影響機制，本研究通過定點突變研究了M314的3個突變位點A128T、H404R和I410L對ADI酶活力和酶學(xué)性質(zhì)的影響。并對M314突變位點進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬分析，A128T有利于形成更多氫鍵，H404位點緊臨催化中心 C405，兩者均處于影響酶活力的重要位置；而I410位點則處于C末端的β折疊上，距酶催化中心較遠(yuǎn)，I410L對ADI三維結(jié)構(gòu)無明顯的改變。本研究首先對3個氨基酸位點A128、H404和I410進(jìn)行單點突變以闡明其對酶活力的影響，為進(jìn)一步雙位點的突變研究提供依據(jù)。實驗結(jié)果顯示，A128T和H404R對ADI的酶活力有顯著影響，而I410L對酶活力影響較小，因此選擇了A128T和H404R作為組合進(jìn)行雙位點突變。通過定點突變法獲得了突變株M1 (A128T)、M2 (H404R)、M3 (I410L) 和M4 (A128T/H404R)，并對WT-ADI及其突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，探討了上述位點對ADI酶活力的影響及其分子機制，為闡明 ADI的酶促反應(yīng)的作用機制和蛋白質(zhì)的理性改造提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

野生型ADI (WT-ADI)、ADI突變株M314 (A128T/H404R/I410L) 及E. coli JM109和BL21 (DE3) 均為本實驗室保藏。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑和設(shè)備

QuikChange 試 劑 盒 (210518) 購 自Stratagene公司；DNA marker、質(zhì)粒小量提取試劑盒、蛋白marker、蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉 (SDS)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟 (PMSF) 等購自上海生工生物工程有限公司；PCR引物合成及測序委托Invitrogen公司 (上海) 進(jìn)行；其他試劑均采用國產(chǎn)分析純試劑。

超凈工作臺 (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，電子天平 (上海精天電子儀器有限公司)，超聲波破碎儀 (寧波新芝生物科技有限公司)，3K15臺式高速冷凍離心機 (Sigma 公司)，蛋白電泳儀及凝膠成像儀 (Bio-Rad 公司)，AKTA avant (GE healthcare公司)，752型紫外可見分光光度計 (上海光譜儀器有限公司) 等。

1.3 定點突變法制備ADI突變株

將攜帶有質(zhì)粒pET24a-ADI的E. coli BL21 (DE3) 基因工程菌接種于 LB/Kan (Kan終濃度30 μg/mL) 液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。具體操按照說明書進(jìn)行。以變形假單胞菌ADI的編碼序列 (GenBank Accession No. EU030267) 為模板，設(shè)計引物 (表1)，突變位點處由下劃線標(biāo)出。

PCR擴增反應(yīng)：總體積為 50 μL，其中QuikChange?Lightning DNA聚合酶 1 μL，10×反應(yīng)緩沖液5 μL，待突變質(zhì)粒模板 (20~50 ng/μL) 1 μL，正向引物 (125 ng) 1.25 μL，反向引物(125 ng) 1.25 μL，dNTPs混合物 1 μL，QuikSolution試劑1.5 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃10 s，68 ℃ 4 min，進(jìn)行18個循環(huán)；68 ℃ 5 min。

表1 定點突變引物Table 1 Primers for site-directed mutagenesis

取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析PCR的擴增情況，然后在剩余的PCR產(chǎn)物中加入2 μL的 Dpn Ⅰ限制性內(nèi)切酶 (專一性消化甲基化質(zhì)粒序列GATC)，于37 ℃條件下反應(yīng)5 min將原始模板序列徹底降解。

將酶切后的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落 PCR驗證，并提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，最后將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，并保藏待用。

1.4 ADI的蛋白質(zhì)純化

將突變株 M1 (A128T)、M2 (H404R)、M3 (I410L)、WT-ADI及M314 (A128T/H404R/I410L)分別接入LB/Kan液體培養(yǎng)基，待OD600為1.0左右，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)5 h后，8 000 r/min離心15 min收集菌體，用磷酸鈉緩沖液 (20 mmol/L，pH 7.0) 洗滌2次，并按菌體濕重/緩沖液1∶6將菌體懸浮，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎 (400 W，10~15 min，超聲1 s，停止3 s)。將破碎液于12 000 r/min離心20 min，上清即為粗酶液。

用溶液A (20 mmol/L，pH 7.0，磷酸鈉緩沖液) 平衡HiPrep DEAE FF離子交換層析柱，上樣后用溶液 A洗脫未吸附蛋白，再用溶液 B (20 mmol/L，pH 7.0，磷酸鈉緩沖液，1 mol/L NaCl) 進(jìn)行線性洗脫。并將活性部分超濾濃縮脫鹽后進(jìn)行凝膠過濾層析。

用溶液C (20 mmol/L，pH 7.0，磷酸鈉緩沖液，0.15 mol/L NaCl) 平衡SuperdexTM200凝膠過濾層析柱，將上步濃縮后的蛋白上樣后以進(jìn)行洗脫。將活性部分收集后于0~4 ℃冰箱保存，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 ADI突變株的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.5.1 ADI的酶活力及比活力測定

ADI酶活力的測定方法同本研究室的文獻(xiàn)報道[18]，簡述如下：

酶活力單位定義：37 ℃時，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol精氨酸鹽酸鹽生成瓜氨酸的酶量定義為1 U。

瓜氨酸含量測定：于10 mL的比色管中依次加入0.5 mL二乙酰一肟-硫胺脲溶液，3 mL混酸溶液 (含 Fe3+)，2 mL不同濃度瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)液(0~50 mg/L)，空白以2 mL的去離子水代替。將混勻好的溶液沸水浴10 min后，冷卻至室溫。按文獻(xiàn)[19]方法測定吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ADI酶活力測定：取50 μL適當(dāng)稀釋濃度的酶液并加入 950 μL底物 (10 mmol/L L-精氨酸，0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 6.0)，終體積為1 mL，于37 ℃條件下反應(yīng)30 min后，100 ℃沸水浴 5 min，使酶失活，終止反應(yīng)。適當(dāng)稀釋后按文獻(xiàn)[19]方法測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其中瓜氨酸含量，并計算酶活。計算公式如下：

蛋白質(zhì)含量的測定：根據(jù)上海生工生物工程有限公司的 Bradford法蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定

取適量純化后的 WT-ADI及其突變酶分別加入到兩種不同pH的磷酸鈉緩沖液 (0.5 mol/L，pH 6.0/pH 7.4) 中，并在不同的溫度 (20 ℃~ 65 ℃，間隔5 ℃) 條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)測定其最適反應(yīng)溫度，所使用的底物濃度為10 mmol/L L-精氨酸，參照 1.5.1部分測定其酶活力，重復(fù)測定3次。以WT-ADI及其突變酶在不同溫度條件下所測得的最高酶活力為100%，其他值與之比較得到的相對值作圖。

取適量純化后的 WT-ADI及其突變酶于不同的溫度 (25 ℃~65 ℃，間隔5 ℃) 條件下處理1 h后，分別在pH 6.0和pH 7.4磷酸鈉緩沖液中測定其酶活力，所使用的緩沖液及底物的濃度均參照酶活力標(biāo)準(zhǔn)測定方法，重復(fù)測定3次。以所測得的最高酶活力為100%，其他值與之比較得到的相對值作圖。

1.5.3 最適pH和pH穩(wěn)定性的測定

將純化后的 WT-ADI及其突變酶在不同的 pH (3.5~9.0) 條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)測定其最適pH值，所使用的緩沖液為0.5 mol/L醋酸鹽緩沖液，pH 3.5~5.5；0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 6.5~8.0；0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.5~9.0。并參照1.5.1部分測定其酶活力，重復(fù)測定3次。以所測得的最高酶活力為100%，其他值與之比較得到的相對值作圖。

取純化后的 WT-ADI及其突變酶在上述中不同pH緩沖液中按相同的體積混勻后，于37 ℃處理1 h，在0.5 mol/L, pH 7.4磷酸鈉緩沖液中參照1.5.1部分測定其酶活力，重復(fù)測定3次。以所測得的最高酶活力為100%，其他值與之比較得到的相對值作圖。

1.5.4 不同突變株精氨酸脫亞胺酶動力學(xué)參數(shù)對比

按文獻(xiàn)[14]的方法，以L-精氨酸為底物，分別在pH 6.0和pH 7.4，0.5 mol/L磷酸鈉緩沖液中，于37 ℃條件下，按照1.5.1部分的酶活力測定方法，測定 WT-ADI及其突變酶在2~10 mmol/L底物濃度下產(chǎn)物瓜氨酸的生成量，重復(fù)測定3次。并按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得Km和Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADI的定點突變

為研究ADI關(guān)鍵氨基酸殘基的作用，采用定點突變技術(shù)首先對ADI突變株M314中氨基酸位點A128、H404、I410進(jìn)行單點突變以闡明這3個位點對精氨酸脫亞胺酶活性的影響，為進(jìn)一步雙位點的突變研究提供依據(jù)。以攜帶有WT-ADI的 pET24a-ADI質(zhì)粒為模板，通過全質(zhì)粒 PCR擴增，獲得了長度約為6.5 kb的特異性條帶，其中pET24a質(zhì)粒的長度約為5 300 bp，ADI基因片段大小約為1 250 bp (圖1)。經(jīng)菌落PCR驗證后，挑取單克隆過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。

經(jīng)序列比對，突變株序列正確。其中M1 (A128T)、M2 (H404R)、M3 (I410L) 和M4 (A128T/H404R) 分別對應(yīng)DNA序列382位(G→A)、1 211至1 212位 (AC→GT)、1 228位(A→C)、382位 (G→A) 和 1 211至 1 212位(AC→GT)。說明通過快速定點突變法獲得了正確的突變株。

2.2 WT-ADI和ADI突變株的純化

WT-ADI及突變株M314、M1、M2、M3和M4經(jīng) HiPrep DEAE FF離子交換層析和SuperdexTM200凝膠過濾層析后均獲得單一條帶，純化后的野生型及突變型ADI的分子量均為46 kDa。SDS-PAGE電泳 (圖2) 顯示了通過離子交換層析和凝膠過濾層析可以獲得電泳純級別的精氨酸脫亞胺酶。

2.3 ADI野生酶和突變株的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶活力比較

結(jié)果如表2所示，當(dāng)pH由6.0升高至7.4時，WT-ADI的比活力從20.20 U/mg降至0.86 U/mg，剩余酶活力僅為4.25%；突變株M1和M2在pH 7.4時比活力分別為3.78 U/mg和8.19 U/mg，與 pH 6.0時相比剩余酶活力分別為 41.17%和76.82%；盡管 M3在 pH 6.0時有較高比活力15.65 U/mg，但在pH 7.4時，剩余酶活力僅為5.05%。鑒于突變位點A128T和H404R對酶活力的顯著影響，因此選擇了A128T和H404R作為組合進(jìn)行雙位點突變研究；同時，結(jié)果顯示，M4突變株在pH 6.0時比活力為13.62 U/mg，在pH 7.4時剩余酶活力仍保留72.03%。因此推測，A128T與H404R對ADI在生理中性條件(pH 7.4) 下的酶活力均有顯著的促進(jìn)作用，而I410L對WT-ADI在pH 7.4條件下對酶活力提高無明顯作用。

圖1 WT-ADI質(zhì)粒模板和QuikChange定點突變PCR擴增產(chǎn)物Fig. 1 Plasmid template and QuikChange PCR product. M: 1 kb DNA marker; 1: plasmid of WT-ADI; 2: PCR products of the A128T site-directed mutagenesis; 3: PCR products of the H404R site-directed mutagenesis; 4: PCR products of the I410L site-directed mutagenesis; 5: PCR products of the A128T/H404R site-directed mutagenesis.

圖2 WT-ADI和ADI突變株M314、M1、M2、M3、M4蛋白質(zhì)純化SDS-PAGE電泳圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the purified WT-ADI, and ADI mutants M314, M1, M2, M3, M4. (A) 1–3: crude enzyme of WT-ADI, HiPrep 16/10 DEAE column of WT-ADI, SuperdexG-200 gelfiltration of WT-ADI; 4–6: crude enzyme of M314, HiPrep 16/10 DEAE column of M314, SuperdexG-200 gelfiltration of M314. (B) 1–3: crude enzyme of M1, HiPrep 16/10 DEAE column of M1, SuperdexG-200 gelfiltration of M1; 4–6: crude enzyme of M2, HiPrep 16/10 DEAE column of M2, SuperdexG-200 gelfiltration of M2. (C) 1–3: crude enzyme of M3, HiPrep 16/10 DEAE column of M3, SuperdexG-200 gelfiltration of M3; 4–6: crude enzyme of M4, HiPrep 16/10 DEAE column of M4, SuperdexG-200 gelfiltration of M4. M: protein marker.

表2 WT-ADI及其突變酶的酶活力比較Table 2 Specific activity of ADI mutants and WT-ADI

表3顯示，在pH 7.4條件下，ADI突變株M1，M2和M4的Km值較野生酶均有顯著降低，在pH 7.4時WT-ADI的Km值由4.41 mmol/L分別降至1.07 mmol/L，1.02 mmol/L和0.83 mmol/L。同時，突變株M1，M2和M4的kcat/Km較野生酶均有大幅度的提高，其中 M4在 pH 7.4時的kcat/Km由2 937 L/(mol·s)升至25 060 L/(mol·s)。從表中可以得出，突變株M1，M2和M4在酶與底物的親和力以及對底物的催化效率方面均有較大提高。

2.3.2 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

本實驗分別考察了 WT-ADI及其突變酶在pH 6.0和pH 7.4條件下的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3A和3B。圖 3A表明，在pH 6.0條件下WT-ADI及其突變株M314、M1、M2、M3和M4酶的最適反應(yīng)溫度均為40 ℃；在pH 7.4條件下WT-ADI及其突變酶的最適反應(yīng)溫度均為35 ℃ (圖 3B)。值得注意的是，作為治療精氨酸缺陷型癌癥的藥物，ADI突變株 M1、M2和M4在人體生理溫度范圍 (35 ℃~ 42 ℃)及生理中性條件下 (pH 7.4) 的酶活力較WT-ADI均有不同程度提高 (圖3B)。

圖4A表明，在pH 6.0時WT-ADI及其突變酶在低于40 ℃的條件下保溫1 h后，ADI各突變酶相對剩余酶活力變化不明顯，在40 ℃~60 ℃條件下，WT-ADI及其突變酶相對剩余酶活力下降顯著。圖4B表明，在pH 7.4時，在20 ℃~40 ℃條件下，WT-ADI及其ADI突變株的相對剩余活力下降幅度較小。在55 ℃~60 ℃條件下保溫1 h后，野生型ADI和突變株M314、M1、M2、M3和M4的相對剩余酶活力迅速下降至最低點。因此，各突變位點對ADI的熱穩(wěn)定性無明顯影響，WT-ADI及其ADI突變株均在20 ℃~40 ℃條件下表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。

表3 pH 7.4條件下WT-ADI及其突變株的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetics parameters of ADI mutants and WT-ADI at pH 7.4

圖3 pH 6.0 (A) 和pH 7.4 (B) 條件下溫度對WT-ADI和ADI突變株酶活力的影響Fig. 3 Effect of temperature on activity of ADI mutants and WT-ADI at pH 6.0 (A) and pH 7.4 (B).

2.3.3 最適反應(yīng)pH與pH穩(wěn)定性

本實驗考察了 WT-ADI及其突變酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5A和5B。圖5A顯示，WT-ADI和M3的最適pH為6.0，M314、M1、M2和M4的最適pH均為6.5，并且M314、M1、M2和M4突變酶的活力較野生酶WT-ADI和突變酶M3有不同程度的提高。結(jié)果表明，A128T和H404R對ADI的最適pH的提高可能有一定的促進(jìn)作用。

圖5B表明，WT-ADI及其突變株在pH低于6.0時穩(wěn)定性明顯下降，相對剩余酶活力均在pH 5.0~5.5時降至最低點。與WT-ADI和其他突變株相比，M314在pH 5.5~8.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的pH穩(wěn)定性，在pH 5.5時的相對剩余酶活力為90%。

圖4 pH 6.0 (A) 和pH 7.4 (B) 條件下WT-ADI和ADI突變株的熱穩(wěn)定性Fig. 4 Thermostability of ADI mutants and WT-ADI at pH 6.0 (A) and pH 7.4 (B).

圖5 (A) pH對WT-ADI和ADI突變株酶活力的影響；(B) WT-ADI和ADI突變株在不同pH條件下的穩(wěn)定性Fig. 5 (A) The optimum pH of ADI mutants and WT-ADI; (B) Stability of ADI mutants and WT-ADI at different pHs.

3 討論

以上結(jié)果表明：在酶活力方面，A128T和H404R對ADI在生理中性 (pH 7.4) 條件下的酶活力有顯著促進(jìn)作用，WT-ADI的比活力由0.86 U/mg提高至3.78 U/mg (M1，A128T)，8.19 U/mg (M2，H404R) 和9.81 U/mg (M4，A128T/H404R)。在動力學(xué)方面，A128T和H404R對ADI在pH 7.4條件下與底物的親和力以及催化效率均有較大提高，M4的Km值由4.41 mmol/L (野生酶) 降至0.83 mmol/L，kcat/Km由2 937 L/( mol·s)升至25 060 L/( mol·s)。在最適pH方面，A128T和H404R對ADI的最適pH的提高具有促進(jìn)作用。

由于兩者蛋白序列同源性約為84%，以來源于銅綠假單胞菌 Pseudomonas aerμginosa 的ADI蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (PDB: 1RXXX) 為模型，采用Swiss-Model對來源于變形假單胞菌 P. plecoglossicida的ADI突變株M314進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)建模，并對M314各突變位點A128T，H404R和I410L的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析 (圖6)。

突變株M1 (A128T) 的酶活力和酶學(xué)性質(zhì)顯示，M1在最適反應(yīng)pH及其穩(wěn)定性方面，與M314表現(xiàn)一致。在三維模擬結(jié)構(gòu)中 (圖 6B)，Ala128位于a-螺旋區(qū)中的loop上，將其替換成Thr后，一方面，由于Thr較Ala更具親水性，a-螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)局部基團間作用力加強，也可能通過鹽橋穩(wěn)定a-螺旋，b-折疊以及ab結(jié)構(gòu)鏈接的區(qū)域，使酶對底物結(jié)合能力增強。另一方面，Thr的R基團含有一個羥基，加強了與相鄰氨基酸殘基Asp131之間的氫鍵，使酶的空間結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖6 M314-ADI的立體結(jié)構(gòu)模型 (A) 及其突變位點A128T (B)、H404R (C) 和I410L (D) 的局部立體圖Fig. 6 Simulated three-dimensinonal structure of M314 and the stereoscopic view of mutations A128T, H404R, and I410L.

對于 M2 (H404R) 位點的酶活力和酶學(xué)性質(zhì)的研究顯示，其對ADI的最適pH的提高有一定的促進(jìn)作用，使該ADI的最適pH由6.0遷移到6.5。Galkin等研究顯示，在銅綠假單胞菌中緊鄰催化中心的H405 (相當(dāng)于本研究的H404位點) 有時會被Arg所取代，其推測H405R是支原體來源的ADI最適pH (6.5) 高于銅綠假單胞菌來源的ADI最適pH (5.6) 可能的原因之一[20]，本研究結(jié)果也驗證了這一推測。本研究中變形假單胞菌來源的 ADI催化中心與銅綠假單胞菌來源的ADI的催化中心一致，從ADI三維模擬結(jié)構(gòu) (圖 6C) 上看，H404同樣緊鄰催化中心(His278-Cys406-Glu224)。由于His和Arg均屬于堿性氨基酸，pI值分別為7.59和10.76，R基pKa分別為6.0和12.48，精氨酸的胍基較組氨酸的咪唑基更易質(zhì)子化，因此在與底物結(jié)合催化的過程中更易形成氫鍵。此外，精氨酸的胍基基團與其附近的極性基團有很強的相互作用，H404R有可能起到對催化中間體起到穩(wěn)定作用，并參與氫鍵網(wǎng)的形成，對2個催化的殘基維持離子狀態(tài)起重要作用。因此，H404R有利于提高ADI酶的最適pH值，及其在中性偏堿條件下的活性和穩(wěn)定性。

突變株M3 (I410L) 的酶活力和酶學(xué)性質(zhì)顯示，M3突變酶與WT-ADI在pH和溫度實驗中，均與野生酶表現(xiàn)相似。如圖6D所示，Ile和leu兩者結(jié)構(gòu)相似且均為疏水性氨基酸，且分子大小、等電點也十分相似，在這種情況下的氨基酸替代一般對ADI的最適pH的遷移沒有顯著影響。

定點突變是研究蛋白質(zhì)及其功能的一種重要的手段[21]，本研究通過快速定點突變，獲得了ADI突變株M1 (A128T)、M2 (H404R)、M3 (I410L)、M4 (A128T/H404R)，研究了不同突變位點對酶活力和酶學(xué)性質(zhì)的影響，為闡明ADI的酶活力機制及蛋白質(zhì)的理性改造提供了實驗依據(jù)。

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