孕中期羊水干細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究

常 穎，高 垚，李 歡，王歡歡，劉松巖＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)一科，吉林 長春 130033；2.長春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130051）

近20年來，生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Ω杉?xì)胞的研究一直沒有中斷。胚胎干細(xì)胞由于既受倫理道德宗教的影響；又有導(dǎo)致畸胎瘤發(fā)生的風(fēng)險，因此其研究遇到阻力［1］。神經(jīng)干細(xì)胞的缺陷一是組織來源受限；二是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境決定著移植細(xì)胞的分化方向［2］，因此其基礎(chǔ)及臨床研究也受到限制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）取材容易，能迅速培養(yǎng)、增殖，便于自體移植，且遺傳背景相對穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，彌補(bǔ)了胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞的缺點(diǎn)［3］，但成人骨髓源MSC的數(shù)量及其增殖分化潛能，會隨著人的年齡增加而下降，且病毒感染率較高。由于采集骨髓MSC須對供者行骨髓穿刺術(shù)，因此其來源受到一定限制，難以產(chǎn)業(yè)化。因此羊水干細(xì)胞（amniotic fluid－derived stem cells，AFCs）做為一種新的干細(xì)胞來源，成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究從人孕中期羊水（h AFC）中分離、提純、擴(kuò)增羊水干細(xì)胞，并分析其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 主要器材與試劑 Amnio MAX－Ⅱ培養(yǎng)基，α－MEM（Gibco公司）；胎牛血清、HEPES緩沖液（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；熒光素標(biāo)記小鼠抗人CD44、CD45抗體；倒置相差顯微鏡（O－lympus）；YJ－2操凈臺（蘇州凈化設(shè)備廠），CO2孵箱（SANYO日本）

1.2 h AFC的原代培養(yǎng) 10例羊水標(biāo)本來自懷孕16－22周行產(chǎn)前檢查或自愿引產(chǎn)的孕婦，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺取得20 ml羊水。取標(biāo)本前均征得孕婦本人同意，并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。羊水標(biāo)本在室溫下1 000／min離心5 min，棄上清，加入Amnio MAX－Ⅱ培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱，出現(xiàn)梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落且達(dá)70%匯合后，0.25%胰蛋白酶1 mmol·L－1EDTA消化后，改用α－MEM＋10%胎牛血清＋4μg／Lb FGF培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，記為第1代（P1）。細(xì)胞生長達(dá)到 融合時按 的比例傳代。原代培養(yǎng)時每天隨機(jī)抽取3個培養(yǎng)孔的AFC作細(xì)胞生長動力學(xué)分析，繪制原代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.3 h AFC的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個培養(yǎng)板的底部，即可用0.25% 胰酶1 mmol·L－1EDT A液消化、分離，然后按3×104／cm2密度傳代接種于6孔培養(yǎng)板中，并記為P1；傳代培養(yǎng)直至貼壁細(xì)胞彼此融合，鋪滿整個培養(yǎng)板的底面。再重復(fù)以上操作，并記為P2，以此類推，傳代培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)衰老征相。傳代培養(yǎng)的接種密度嚴(yán)格控制在與原代培養(yǎng)接種密度相同的水平以便于對照。每天隨機(jī)抽取3個培養(yǎng)孔的AFC作細(xì)胞生長動力學(xué)分析，繪制傳代細(xì)胞培養(yǎng)的生長曲線分析。

1.4 h AFC細(xì)胞表面分子測定 第10代細(xì)胞80%～90%融合后，用0.25%胰酶1 mmol·L－1EDTA液消化細(xì)胞，制成2×105／ml的單細(xì)胞懸液，分別加入3個Eppendof管中。A管為標(biāo)準(zhǔn)對照，加入5μl IgG1－FITC的單克隆抗體；B管加入5μl CD44－FITC單克隆抗體；C管加入5μl CD45－FITC單克隆抗體，室溫反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 羊水細(xì)胞核型分析 取生長良好的細(xì)胞第10代、20代羊水干細(xì)胞進(jìn)行核型分析。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，培養(yǎng)4 h后胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后固定、制片、Gimsa染色后鏡下觀察并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 h AFC的分離、純化、擴(kuò)增 實驗收集的10例孕中期羊水標(biāo)本原代培養(yǎng)成功9例。原代培養(yǎng)4 d可見有細(xì)胞貼壁，平均7 d左右散在的梭形細(xì)胞為主、類成纖維細(xì)胞的細(xì)胞集落。平均14天左右可達(dá)80%融合（圖1A）。傳代培養(yǎng)后，12 h即可貼壁，細(xì)胞呈較均一的長梭形，7 d左右細(xì)胞可鋪滿整個培養(yǎng)瓶底面，可繼續(xù)傳代擴(kuò)增。經(jīng)擴(kuò)增5代后可獲得3×109個細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（圖1B），性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2 h AFC原代和傳代培養(yǎng)的生長曲線分析 原代培養(yǎng)細(xì)胞生長潛伏期4－6 d，此期主要為細(xì)胞貼壁生長階段，有絲分裂活動不活躍；第7天倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞形成大小不一的多個細(xì)胞克隆，有絲分裂開始變得活躍；第7－13天，細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大，許多克隆彼此相連，此階段細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)遞增，此期為h AFC原代培養(yǎng)的對數(shù)增殖期；第14～18天，細(xì)胞克隆彼此相連并鋪滿整個培養(yǎng)孔底面，細(xì)胞生長曲線顯示h AFC生長進(jìn)入平臺期；第18天，貼壁生長的h AFC鋪滿整個培養(yǎng)孔底面，原代培養(yǎng)結(jié)束。傳代細(xì)胞比原代細(xì)胞的生長要快些，一般12 h即開始貼壁，多于一周左右即可鋪滿整個培養(yǎng)孔底面。本實驗選擇P5、P15、P20傳代培養(yǎng)的生長曲線（見圖2）進(jìn)行觀察比較，發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)具有以下共性特征：傳代培養(yǎng)的生長潛伏期1－2 d，對數(shù)增長期3－6 d，生長平臺期7－10 d。傳代培養(yǎng)細(xì)胞在P25代以后開始出現(xiàn)衰老征相。

2.3 h AFC表型 h MSC均一表達(dá)CD44，但CD45陰性（見圖3）。

2.4 第10代、20代羊水干細(xì)胞檢測干細(xì)胞核型正常，為46XX和46XY。

3 討論

羊水干細(xì)胞做為一種新的干細(xì)胞來源，最早是在2003年被 Prusa［4］等發(fā)現(xiàn)；2007年，Paolo［5］等將由羊水中分離獲得的干細(xì)胞命名為羊水干細(xì)胞（AFC），這種細(xì)胞表達(dá) MSC（Mesenchymal stem cell）、不表達(dá)造血細(xì)胞系標(biāo)記，90%的細(xì)胞表達(dá)Oct－4；這一發(fā)現(xiàn)引發(fā)了羊水干細(xì)胞研究的熱潮，羊水干細(xì)胞有望成為新的干細(xì)胞種子來源，應(yīng)用于細(xì)胞及基因治療。目前對干細(xì)胞的體外分離純化技術(shù)大多建立在對細(xì)胞表面標(biāo)記識別的基礎(chǔ)之上，具體的方法有流式細(xì)胞分離法、免疫磁珠分選法；另外還有依據(jù)分選細(xì)胞的物理性質(zhì)所采用的梯度離心法和組織消化法；還有也可運(yùn)用特定的培養(yǎng)基的選擇作用和機(jī)械分離方法分離純化干細(xì)胞。本實驗即采用羊水專用培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司 Aminio MAX－Ⅱcomplete培養(yǎng)基，結(jié)合機(jī)械分離方法從羊水中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。

hFSC原代細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線顯示，h FSC在體外培養(yǎng)條件下的生長與其他細(xì)胞一樣經(jīng)歷了生長滯緩期、對數(shù)增殖期、生長平臺期。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般4 d左右細(xì)胞開始貼壁，并形成散在的細(xì)胞集落。細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶需大約2周（14 d）的時間。h FSC傳代細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線顯示，細(xì)胞生長的潛伏期縮短，一般4 h即開始貼壁，12 h完全貼壁，1周左右即可長滿整個培養(yǎng)瓶。經(jīng)擴(kuò)增5代后可獲得3×109個細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定，傳代到第20代細(xì)胞核型仍保持正常。因此，通過離體培養(yǎng)，使羊水中低峰度的MSC在體外實現(xiàn)擴(kuò)增是可行的。羊水干細(xì)胞的這些特性使其成為組織工程中進(jìn)行細(xì)胞治療的理想的種子細(xì)胞，有很大的臨床應(yīng)用前景。經(jīng)歷了25代傳代培養(yǎng)，h FSC開始出現(xiàn)衰老征相：即細(xì)胞生長速度緩慢，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂和從培養(yǎng)板底脫落等。此結(jié)果和Kim［6］等的研究結(jié)果一致。

雖然目前國內(nèi)外的科學(xué)家都致力于羊水干細(xì)胞的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)AFC特征性的表面標(biāo)記。AFC在細(xì)胞表型上類似于胚胎干細(xì)胞和成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，即SH2、CD44和CD90陽性，CD34、CD45和CD117 HLADR陰性［7］；在AFSC表面標(biāo)記中引人注意的是POU轉(zhuǎn)錄因子4（Oct－4）等胚胎特異性標(biāo)記的表達(dá)［8］，提示羊水中存在比間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育更原始、增殖和分化能力更強(qiáng)、更接近于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞。本實驗流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD45，因此證明我們培養(yǎng)的羊水細(xì)胞是具有MSC特性的干細(xì)胞。

本實驗對孕中期羊水來源的干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為羊水干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)提供了簡便易行的操作方法。但此研究還只處于初級階段，進(jìn)一步的深入研究羊水干細(xì)胞的生物學(xué)特性對應(yīng)用于基因疾病的臨床治療具有重要意義。

圖2 原代、傳代hFSC生長曲線

圖3 hFSC細(xì)胞表型

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