聯(lián)合檢測法對早期深部侵襲性真菌感染的臨床應(yīng)用研究

易震南，黎東明

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001）

最近十幾年里由于大量廣譜抗生素、放化療治療的普遍使用以及各種免疫制劑的使用，侵襲性真菌感染的病例數(shù)量逐步上升，重點科室是呼吸科，其兩大感染源是念珠菌以及曲霉，死亡率分別達(dá)到50%以及40%，因此早期確診對于此種疾病的治療并降低患者的死亡率有非常重要的意義［1］。臨床中常用的檢測方法為微生物培養(yǎng)以及影像學(xué)等，但都存在著不同的缺陷，如敏感性不強(qiáng)及耗費時間，而最近幾年中運用較多的（1－3）β－D－葡聚糖試驗（G 試驗）則有敏感性高以及快速的優(yōu)點。為更好地侵襲性真菌感染進(jìn)行檢測，我們將細(xì)菌培養(yǎng)與G實驗進(jìn)行聯(lián)合，探討其在臨床檢驗中的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院呼吸科自2009年1月至2010年12月收治的疑為侵襲性肺部真菌感染的患者，共96例，男性患者52例，女性患者44例，年齡皆在60歲以上，平均年齡是（72±6.2）歲。對于侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)，每位患者都至少符合其中的一項，而且所有患者的痰液培養(yǎng)結(jié)果均顯示為陽性。

1.2 實驗器材

奧林巴斯BF－260電子支氣管鏡；MB－80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)；恒溫儀；水浴槽；渦旋振蕩器；GKT－5M Set動態(tài)真菌檢測試劑盒；相應(yīng)質(zhì)控品（均購自北京金山川科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 擬診為真菌感染的患者分別于入院的當(dāng)天、第二天以及第三天的清晨進(jìn)行深部取痰，用以痰細(xì)菌涂片以及真菌培養(yǎng)

1.3.2 經(jīng)纖支鏡對所有患者進(jìn)行支氣管肺泡灌洗以及活組織檢查，或者進(jìn)行經(jīng)皮肺穿刺活檢，直至患者確診。其中支氣管肺泡灌洗的方法為：（1）在要進(jìn)行灌洗的肺組織處做活檢孔，將一細(xì)硅膠管插入活檢孔，注入濃度為2%的利多卡因，劑量為2ml，對灌洗肺組織進(jìn)行局部麻醉；（2）將纖支鏡的頂端楔入段或者亞段支氣管開口處，連接要緊密，通過硅膠管注入滅菌的生理鹽水，溫度為37℃，總劑量為100 ml，每次劑量為25到50 ml，注入要迅速；（3）立即通過負(fù)壓吸引對灌洗液進(jìn)行回吸，壓力為50到100 mm－Hg，灌洗液的回收率約為40%到60%；（4）將無菌紗布疊為雙層，立即對回收液進(jìn)行過濾，記錄濾液量；（5）將濾液裝入硅塑瓶，目的是減少細(xì)胞的黏附，將硅塑瓶置于保溫瓶內(nèi)，加入冰塊，即刻送往實驗室；

1.3.3 取患者血清以及肺泡灌洗液，進(jìn)行（1－3）β－D－葡聚糖試驗（G試驗）；

1.4 診斷指標(biāo)

確診——具有組織學(xué)特征和（或）無污染條件下取得的標(biāo)本顯示為陽性；

臨床診斷——具有高危因素＋臨床特征＋微生物檢測（或）抗真菌治療顯效；

擬診——只有高危因素以及臨床特征；

定植——不存在致病性，不需要治療。

2 結(jié)果

2.1 患者痰培養(yǎng)結(jié)果

痰培結(jié)果顯示患者感染細(xì)菌為兩大類，念珠菌以及曲霉菌，感染例數(shù)分別為89例和7例，其中確診病例有19例，臨床診斷病例有16例，擬診為29例，32例為定植，詳見表1。

表1 侵襲性肺部真菌感染患者痰培結(jié)果

2.2 患者血清及灌洗液的G試驗結(jié)果

G試驗結(jié)果顯示血清樣本的葡聚糖濃度在4個組別中的水平與灌洗液樣本的濃度有良好的一致 性，詳見表2。

表2 血清與灌洗液樣本的G試驗結(jié)果（pg／ml）

2.3 患者血清G試驗結(jié)果在4組中分布情況

G試驗的診斷閾值為20 pg／ml，真菌感染組包括確認(rèn)組和臨床診斷組，陰性對照組為非真菌感染組，在血清診斷中，G試驗的敏感性以及特異性分別為77.1%和82.8%。其中濃度高于20 pg／ml的患者有27例，詳見表3。

表3 血清樣本G試驗結(jié)果在4組中的分布

2.4 患者支氣管肺泡灌洗液樣本G試驗結(jié)果在4組分布情況

G試驗的診斷閾值為20 pg／ml，真菌感染組包括確認(rèn)組和臨床診斷組，陰性對照組為非真菌感染組，在支氣管肺泡灌洗液樣本中，G試驗的敏感性以及特異性分別為85.7%和82.8%。其中濃度高于20 pg／ml的患者有30例，詳見表4。

表4 灌洗液樣本G試驗結(jié)果在4組中的分布

3 討論

侵襲性真菌感染的感染菌主要為念珠菌以及曲霉，其高?；颊叨酁閻盒阅[瘤患者以及免疫力低下的危重癥患者［2］。大部分的真菌感染患者并不存在非常明顯的臨床體征，與其他類型的侵襲性疾病之間的區(qū)分比較困難。在其早期進(jìn)行確診并查明病原菌，已經(jīng)成為臨床工作中的重要任務(wù)。

3.1 檢測侵襲性真菌感染的方法

目前檢測侵襲性真菌感染的途徑主要有兩種，一種是培養(yǎng)法，它是臨床上的常規(guī)檢測方法，但培養(yǎng)法有諸多不足，如培養(yǎng)時間較長以及較低的特異性和敏感性；另一種是非培養(yǎng)法，包括血清學(xué)以及分子生物學(xué)兩個方面，本文所探討的（1－3）β－D－葡聚糖試驗（G試驗）就屬于血清學(xué)的方法，在最近幾年當(dāng)中，這種方法越來越多地被用于侵襲性真菌感染的檢測，其檢測時間較短，而且有較高的敏感性和特異性［3］。

3.2 G試驗的原理以及優(yōu)缺點

（1－3）β－D－葡聚糖是一種多糖，幾乎全部真菌的細(xì)胞壁當(dāng)中都有這一種組分，但人體的細(xì)胞壁當(dāng)中并不含有這種成分，在念珠菌以及曲霉菌引起的疾病的早期診斷可以使用 G試驗［4］，2003年美國FDA已對該實驗進(jìn)行了批準(zhǔn)，允許其用于檢測侵襲性真菌感染，歐洲腫瘤研究治療組織中的IFICG以及NIAID也于2008年對G試驗做了定位，將其列為侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。國外眾多研究中心已做了相關(guān)的回顧性調(diào)查，且數(shù)量巨大，證實了該實驗有較好的敏感性以及特異性。

G試驗是通過檢測病菌的抗原來達(dá)到檢測的目的［5］，但要注意幾個方面的問題：抗原能夠被免疫復(fù)合物清除，如果體內(nèi)有這類物質(zhì)，抗原的敏感性就會大大降低［6］，因此在檢測之前需解離樣本當(dāng)中的免疫復(fù)合物；若使用多抗進(jìn)行敏感性的檢測，極易出現(xiàn)批間變異的現(xiàn)象，同時也會發(fā)生交叉反應(yīng)，所以檢測的抗原應(yīng)盡量選擇單抗［7］；（3）部分抗原的檢測并不具有較高的靈敏性，故對這一部分抗原要改進(jìn)其檢測方法，提升敏感性。

在某些情況下，G檢驗可能會出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，這種情況在國內(nèi)外的研究領(lǐng)域也普遍存在。比如進(jìn)行血液透析的患者、藥物治療中含有葡聚糖的患者，所以G試驗的檢測結(jié)果需要與常規(guī)檢測結(jié)果緊密結(jié)合，同時配合臨床的癥狀，對患者情況進(jìn)行最終的確診。

3.3 GM－EIA試驗

另外一種通過檢測抗原診斷侵襲性真菌感染的方法是半乳甘露聚糖法（GM）。曲霉菌的細(xì)胞壁上有GM，因此GM通常用于檢測曲霉菌，在曲霉菌的菌絲生長時，GM即被釋放，進(jìn)入周圍組織。有相關(guān)研究報道指出，半乳甘露聚糖－酶聯(lián)免疫分析（GMEIA）可用于檢測侵襲性曲霉病，尤其是對于患有惡性血液病的患者，但是，對于進(jìn)行器官移植的接受者，這種檢測作用并不明顯；若患者的侵襲性曲霉病疑似性較高，則GM－EIA則會顯示出良好的敏感性以及特異性，甚至有很高的陽性預(yù)測值以及陰性預(yù)測值；若被診斷為高疑侵襲性曲霉病患者在，則其GM的抗原水平會顯著降低，且預(yù)后效果較好；若GM不降反升或維持不變，則表示療效不良。治療效果可以通過血清中GM的水平反映出來，對患者進(jìn)行抗真菌治療，可以大幅減少血清中抗原數(shù)量，GM－EIA的敏感性也隨之下降。

3.4 檢測侵襲性真菌感染的分子學(xué)方法

3.4.1 DNA序列比對 這種方法的原理是，兩個序列進(jìn)行彼此之間的相似區(qū)域的對比，同時輔以對比保守型位點，探尋它們之間的進(jìn)化關(guān)系。對于生長緩慢的病原真菌可以用這種方法進(jìn)行鑒定，但病原真菌在臨床當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的種類在持續(xù)增長，故此種方法更適用于對新發(fā)現(xiàn)的真菌進(jìn)行鑒定，且有著很高的特異性。DNA序列方法的不足在于檢測時間較長，至少需48小時，而其敏感性也受眾多因素的影響，如標(biāo)本的類型以及其DNA的提取方法，而且若因環(huán)境當(dāng)中存在真菌，這種方法是無法對其排除的。

3.4.2 PCR產(chǎn)物電泳 這種方法的原理是，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的各種片段具有不同的長度以及種屬，利用這種特異性，在DNA進(jìn)行擴(kuò)增時，對其產(chǎn)物進(jìn)行電泳［8］。但這種方法有比較大的局限性，若不同種類的微生物所具有的片段是大小相同的時候，這種鑒定的結(jié)果可能就會不準(zhǔn)確。對毛細(xì)管電泳的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時，使用的是熒光分析器，其靈敏度非常高，精確到1個堿基，同時也有這相當(dāng)高的工作效率，半小時內(nèi)檢測的樣本可大96個。但若病原真菌有較高的變異性，則不適合使用這種方法。

綜上所述，血清學(xué)的特點是比較簡便而且快速，在真菌感染方面，最有前途的診斷措施是抗原檢測，且已有相當(dāng)數(shù)量的試劑盒面市，但是還需對各種方法進(jìn)行廣泛的研究和檢測，證實其敏感性以及特異性。

從本次的研究可以看出，常規(guī)的培養(yǎng)方法與G試驗檢測的結(jié)果有著比較高的一致性，能夠?qū)颊哌M(jìn)行更迅速、更精確的診斷。侵襲性真菌感染的診斷途徑較多，但技術(shù)方面不夠純熟，使用聯(lián)合檢測的方法對其進(jìn)行診斷具有十分重要的意義。

目前，針對侵襲性真菌感染的檢測技術(shù)依舊有限，比較理想的途徑應(yīng)更快速、操作簡單，同時具備高度的敏感性以及特異性，臨床對侵襲性真菌感染的檢測必須聯(lián)合多種技術(shù)，最終達(dá)到確診的目的。

［1］李若瑜.多學(xué)科攜手應(yīng)對侵襲性真菌感染的挑戰(zhàn)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90（6）：361.

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［3］李世榮，王 紅，文 艷.血漿（1，3）一β一D葡聚糖與抗深部白色念珠菌感染藥物療效關(guān)系的實驗研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2009，7（9）：20.

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［5］俞萬鈞，傅中明.血清半乳甘露聚糖對侵襲性真菌感染的早期診斷價值（2010）［J］.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（2）：489.

［6］Del Palacio A，Cuetara MS.Pontom Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis［J］.Iberoam Micol，2009，16（6）：90.

［7］李若瑜，高露娟.血清半乳甘露聚糖和血漿（1，3）β－D一葡聚糖檢測診斷侵襲性真菌感染［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，40（7）：371.

［8］Obayashi T，Yoshida M ，Mori T，et al.Plasma—beta—Dglucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes［J］.Lancet，2009，356（8941）：17.