臨床常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌耐藥情況及其aac（6’）－Ib－cr基因檢測(cè)結(jié)果分析

吳玉紅，白麗霞，楊 虹

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518036）

隨著喹諾酮類和氨基糖甙類兩種藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，兩者的耐藥性也在逐漸上升。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥研究，國(guó)內(nèi)外早期的研究主要集中于染色體介導(dǎo)［1］的喹諾酮耐藥機(jī)制，而近年來(lái)，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥備受關(guān)注，尤其是最近發(fā)現(xiàn)的能使氨基糖甙類藥物和氟喹諾酮類藥物同時(shí)失活的氨基糖甙乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異基因aac（6’）－Ibcr，該基因編碼的滅活酶可使環(huán)丙沙星及諾氟沙星中的氨基氮發(fā)生乙?；?，從而使其抗菌活性下降。研究顯示該基因可使細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星及諾氟沙星的最小抑菌濃度（MIC值）上升4倍［2］。本研究了解我院2011年臨床常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌的耐藥狀況及其質(zhì)粒介導(dǎo)的能使喹諾酮類和氨基糖甙類藥物同時(shí)耐藥的基因aac（6’）－Ib－cr的流行分布狀況，從而比較分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌種中的分布差異。目前國(guó)內(nèi)對(duì)aac（6’）－Ib－cr基因研究甚少，而且尚無(wú)該基因在不同菌屬間分布差異的相關(guān)研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 本研究收集2010年從臨床分離的299株非重復(fù)的臨床常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌，其中53株鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanni，Aba）、66株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pae）、83株大腸埃希菌（Escherichia coli，Eco）和97株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）。

1.1.2 主要試劑 培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基（Columbia基礎(chǔ)＋5 ml／dl脫脂羊血）；細(xì)菌鑒定和藥敏試劑為MicroScan；Taq DNA Polymerase聚合酶及PCR相關(guān)材料購(gòu)自Fermentas生物工程公司；引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司（Invitrogen Trading（shanghai）Co，Ltd）合成。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀為美國(guó) MicroScan Walk Away 40；BIO－RAD（美國(guó)）公司生產(chǎn)的C1000TMThermalCycler PCR儀；Eppendorf（德國(guó)）生產(chǎn)的Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)；BIO－RAD（美國(guó)）生產(chǎn)的 Power Pac Basic PowePac HC電泳儀；BIO－RAD（美國(guó)）生產(chǎn)的 Gel Doc XR＋凝膠成像及分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及其MIC值的測(cè)定：用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀MicroScan Walk Away 40進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)（MIC值），并嚴(yán)格按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.2 PCR模板的提?。褐蠓蟹ㄌ崛〖?xì)菌基因組DNA。將細(xì)菌接種于LB平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，次日選單個(gè)菌落于LB平板分純，37℃培養(yǎng)。第三天挑取數(shù)個(gè)菌落入盛有180μl的雙蒸水（DDH2O）EP管中，煮沸10 min，13 000 r／min離心3 min。取上清液即細(xì)菌DNA模板于EP管，在－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因aac（6’）－Ib的 PCR 篩選及aac（6’）－Ib－cr的確定：采用PCR檢測(cè)所有菌株的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因aac（6’）－Ib；并以內(nèi)切酶BtsCI酶切消化aac（6’）－Ib的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物以確定aac（6’）－Ib－cr。

aac（6’）－Ib引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［3］，上游引物5’－TTGCGATGCTCTATGAGT－GGCTA－3’和 下 游引物5’－CTCGAATGCCTGGCGTGTTT－3’，產(chǎn)物482 bp。反應(yīng)條件：94℃變性45 S，55℃退火45 S，72℃延伸45 S，34個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物5μl上樣，1.5 g／dl瓊脂糖凝膠中電泳1.0 h，電壓100 V，Gel Red染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并掃描成像。

基因 aac（6’）－Ib－cr確定：用內(nèi)切酶法從 aac（6’）－Ib的 PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物中檢測(cè)。用 BtsCI（New England Biolabs，Beverly，Mass）對(duì)aac（6’）－Ib陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化實(shí)驗(yàn)。由于aac（6’）－Ib－cr缺乏內(nèi)切酶BtsCI的酶切位點(diǎn)，而野生型具有此酶切位點(diǎn)。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，兩條帶的為aac（6’）－Ib－cr陰性株即為aac（6’）－Ib；不能被酶切即只有一條帶者為aac（6’）－Ib－cr陽(yáng)性株［3］。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌種中的分布差異。比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的耐藥情況 在上述4種菌株中，氨芐西林耐藥率最高，達(dá)75.3%，其次是頭孢唑林，耐藥率為58.5%；環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為25.1%和16.7%；哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星和亞胺培南的敏感率均在90%以上。具體耐藥情況見(jiàn)表1。

2.2 基因aac（6’）－Ib和aac（6’）－Ib－cr的陽(yáng)性率共檢出aac（6’）－Ib基因29株，其中鮑曼不動(dòng)桿菌5株，大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib。有21株變異為aac（6’）－Ib－cr，變異率為72.4%（21／29）；aac（6’）－Ib－cr的總陽(yáng)性率為7.0% （21／299），其中大腸埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其陽(yáng)性率為11.67%（21／180），而在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝14.932，P＜0.01）。

表1 299株臨床常見(jiàn)的革蘭陰性菌耐藥情況（%）

3 討論

隨著抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥率也在不斷翻番。本研究在來(lái)自臨床299株常見(jiàn)的革蘭陰性桿菌中，氨芐西林耐藥率已高達(dá)75.3%，頭孢唑林的耐藥率為58.5%，復(fù)方新諾明的耐藥也接近50%，這說(shuō)明曾經(jīng)是抗感染的前線藥物，已經(jīng)被細(xì)菌的反抗打垮了。但是這也催生了新藥的陸續(xù)出現(xiàn)，在抗感染的任務(wù)中，頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南等耐藥率在20%左右的抗菌藥可以發(fā)揮中間力量的作用。最后，拿出目前大家都公認(rèn)的一線藥如亞胺培南、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星等，在本研究中它們的敏感率都超過(guò)了90%。當(dāng)然，最近還出現(xiàn)了如頭孢哌酮／舒巴坦、替加環(huán)素等新藥，針對(duì)耐碳青霉烯類藥物的細(xì)菌發(fā)揮著重要作用。縱使這樣，臨床醫(yī)生一樣要慎用抗生素，為抑制超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)；而且刻不容緩，因?yàn)橐延醒芯繄?bào)道［4］在ICU，鮑曼不動(dòng)桿菌除了亞胺培南外，對(duì)其他如哌拉西林／他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星、左旋氧氟沙星等13種抗菌藥物的耐藥率均超過(guò)50%。

在本研究中，環(huán)丙沙星的耐藥率較高，達(dá)到了25.1%，要慎選，而左氧氟沙星耐藥率相對(duì)低一些（16.7%），可優(yōu)先于環(huán)丙沙星選用；對(duì)于氨基糖甙類藥物，盡管阿米卡星耐藥率在5%以下，但是慶大霉素和妥布霉素耐藥率卻分別達(dá)到了19.7%和13.7%。因此，喹諾酮類和氨基糖甙類的抗菌活性也不容樂(lè)觀，細(xì)菌對(duì)其耐藥的機(jī)制研究也在不斷升溫。就aac（6’）－Ib－cr而言，它是世界上首次發(fā)現(xiàn)的能同時(shí)導(dǎo)致氨基糖甙類和喹諾酮類兩種藥物失活的一種酶［2］，而且還能提高暴露于環(huán)丙沙星的菌株發(fā)生染色體突變的幾率。另外，此研究還發(fā)現(xiàn)aac（6’）－Ib－cr是通過(guò)對(duì)喹諾酮類藥物哌嗪環(huán)上氨基氮原子的乙?；饔枚弓h(huán)丙沙星失活而介導(dǎo)低水平耐藥，而對(duì)左氧氟沙星、莫西沙星等其它的喹諾酮類抗生素并不起作用（在結(jié)構(gòu)上這些藥物合成時(shí)哌嗪環(huán)的氨基已被甲基取代），這種現(xiàn)象可以在一定程度上說(shuō)明細(xì)菌為適應(yīng)外界環(huán)境而發(fā)生了進(jìn)化。甚至?xí)粫?huì)出現(xiàn)能讓3種或3種以上的抗菌藥物耐藥的基因，這都是一種可怕而又可能的猜測(cè)。

在檢出aac（6’）－Ib基因29株中，鮑曼不動(dòng)桿菌僅占5株，大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib。也就是說(shuō)腸桿菌科細(xì)菌占了82.8%（24／29），而非發(fā)酵菌僅占17.2%。同時(shí)有21株aac（6’）－Ib基因變異為 aac（6’）－Ib－cr，變異率為72.4%（21／29）；為什么 aac（6’）－Ib基因的變異率會(huì)如此高呢？這值得再深入研究。aac（6’）－Ib－cr的 總 陽(yáng) 性 率 為 7.0% （21／299），其中大腸埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其陽(yáng)性率為11.67%（21／180），而在鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌中未檢出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。為什么aac（6’）－Ib－cr在腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵細(xì)菌中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也許還需要進(jìn)行大量研究，可能aac（6’）－Ib－cr基因還有更多的生物學(xué)價(jià)值有待發(fā)現(xiàn)。

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