人生長激素對人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

乳腺癌是嚴重危害婦女健康的常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的首位。近年來，乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢［1］。國內(nèi)外研究表明，重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rh GH）能顯著改善晚期惡性腫瘤患者的營養(yǎng)狀況，使其代謝調(diào)理和免疫調(diào)節(jié)作用加強［2］，提高患者治療效果及耐受性［3］。但rh GH作為惡性腫瘤患者的免疫、營養(yǎng)輔助治療劑應(yīng)用于臨床，至今仍存在爭議［4］，以至于醫(yī)生及患者對rh GH安全性存在顧慮［5］。本研究旨在探討人生長激素對人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響，希望能為臨床治療乳腺癌提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

4－6周齡健康雌性BALB／c裸鼠40只，體質(zhì)量14－25 g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心；人乳腺癌細胞株MCF－7購自中國科學(xué)院細胞生物庫；rh GH購自上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司，批號：20070621）；5－氟尿嘧啶（5－FU，0.025 g／m L，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)）；流式細胞儀（上海凈化設(shè)備公司）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL）試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立、分組及給藥方法 以含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況進行傳代。待至細胞數(shù)量足夠時，將1×107株人乳腺癌細胞 MCF－7懸浮于1 m L的細胞懸液，以0.1 m L／只接種于裸鼠的右臀部皮下。待瘤體長至長徑1.0 cm左右，處死裸鼠，取出移植瘤，把2 mm×2 mm×2 mm的瘤體包塊接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，于無特定病原體（SPF級）條件下飼養(yǎng)，接種后10 d，選取瘤體生長良好的裸鼠采用簡單隨機分組方法隨機分成4組：對照組、rh GH 組、5－FU組和rh GH＋5－FU組，每組10只裸鼠。分組后當日給藥，對照組皮下注射與rh GH組等體積的生理鹽水0.2 m L，5－FU 組按2 mg／kg 5－FU 溶液給予皮下注射，rh－GH組按2.5 IU／kg rh GH溶液給予皮下注射，rh－GH＋5－FU組同5－FU組和rh GH組，每天1次，連續(xù)給藥2周。

1.2.2 指標測定 （1）移植瘤瘤重：將剝出的腫瘤去除血污、脂肪等非瘤組織，稱量瘤質(zhì)量。（2）病理組織學(xué)檢查：取移植瘤組織約0.3 cm。，用4%甲醛固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察計數(shù)5個以上不少于1 000個細胞的高倍視野。免疫組法檢測移植瘤核增殖抗原（PCNA），TUNEL法檢測凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)（AI）。PCNA陽性細胞判斷：細胞核出現(xiàn)明顯的深棕色，凋亡細胞細胞核出現(xiàn)棕黃色。AI計算公式如下：AI＝（陽性細胞數(shù)／總細胞數(shù)）×100%。（3）流式細胞術(shù)：分組培養(yǎng)同上，rh GH培養(yǎng)24 h后消化、離心，PBS洗滌2次，70%乙醇固定并4℃過夜。測定前先用PBS洗滌，重懸于緩沖液中，各組細胞濃度約1.5×105／m L。加入1 g／L RNA酶100μL，室溫放置1 h，再加入50 mg／L碘化丙啶100μL，避光放置1 h，立即行流式細胞儀定量檢測G0／G1期、S期和G2M期人乳腺癌細胞數(shù)目，計算細胞凋亡率。細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）按公式計算；PI＝（S＋G2M）／（G0／G1＋S＋G2M）？100%。MTT法檢測細胞存活率，在酶標儀上讀取光密度（OD）值，檢測波長620 nm。細胞存活率（%）＝實驗組OD值／對照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q法分析，兩變量間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；計數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗2周后，與對照組相比，5－FU組和rhGH＋5－FU組的腫瘤質(zhì)量、PI及S的指標數(shù)值明顯小于對照組，AI、G0／G1期的指標數(shù)值明顯大于對照組（均P＜0.01）；與5－FU 組相比，rh GH＋5－FU 組的PI及G2M期的指標數(shù)值明顯小于5－FU組，G0／G1期存活率明顯優(yōu)于5－FU組（P＜0.05或P＜0.01），其余各項指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響情況比較結(jié)果見表1，圖1－3。

表1 各組人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響情況比較（n＝10，±s）組別 腫瘤質(zhì)量（g） PI（%） AI（%） G0／G1期（%） S期（%） G2 M期（%）對照組（1） 0.421±0.102 52.35±0.94 5.04±0.87 47.32±3.17 38.34±1.87 13.64±0.53 rhGH組（2） 0.383±0.029 53.50±0.62 5.21±1.06 46.25±5.30 39.14±1.99 14.07±1.61 5－FU組（3） 0.172±0.017＊＊ 42.07±0.54＊＊ 7.43±1.38＊ 60.48±6.01＊＊ 26.15±1.83＊＊ 17.82±2.59＊rhGH＋5－FU組（4） 0.114±0.024＊＊ 29.21±0.61＊＊ 7.95±1.29＊ 73.13±4.98＊＊ 21.11±1.05＊＊ 9.25±2.05＊F 15.418＊＊ 15.088＊＊ 7.952＊ 15.296＊＊ 15.165＊＊ 8.872＊q（1）：（2） 1.702 1.035 1.039 1.031 1.024 1.004（10）：（3） 4.825＊＊ 4.790＊＊ 3.532＊ 4.502＊＊ 5.150＊＊ 1.017（1）：（4） 5.012＊＊ 5.123＊＊ 3.785＊ 5.402＊＊ 5.302＊＊ 2.098（2）：（3） 4.907＊＊ 5.004＊＊ 3.603＊ 4.760＊＊ 4.954＊＊ 1.035（2）：（4） 5.013＊＊ 4.828＊＊ 3.748＊ 5.108＊＊ 5.609＊＊ 3.104＊（3）：（4） 2.406 3.819＊ 1.801 3.631＊ 1.014 3.309＊＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖1 給藥結(jié)束后流式細胞儀檢測乳腺癌移植瘤細胞周期掃描圖

由圖1可看出給藥結(jié)束后各組G0－G1期和G2M期細胞百分數(shù)比較均無差異。S期：5－FU組和5－FU＋rh GH組比對照組或rh GH組明顯降低；而rhGH組與對照組比較無差異。

在給藥后，對照組和rh GH組的PCNA呈陰性，而5－FU組和rhGH＋5－FU組的PCNA呈陽性，且rh GH＋5－FU組的顏色較5－FU組淺，見圖2。對照組和rhGH組的乳腺癌移植瘤細胞凋亡呈陰性，而5－FU組和rh GH＋5－FU組的乳腺癌移植瘤細胞凋亡呈陽性，且rhGH＋5－FU組的乳腺癌移植瘤細胞凋亡程度明顯高于5－FU組，見圖3。

圖2 給藥結(jié)束后檢測乳腺癌移植瘤PCNA（免疫組化×400）

圖3 給藥結(jié)束后乳腺癌移植瘤細胞凋亡（TUNEL法×40）

3 討論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的復(fù)雜過程，是婦女常見的惡性腫瘤之一。一般惡性腫瘤患者處于高分解狀態(tài)，易產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥，使患者機體免疫功能低下，影響治療效果及康復(fù)。以往研究表明，單純給予靜脈高價營養(yǎng)（TPN）注射不能顯著改善患者高分解代謝和免疫功能低下狀態(tài)［6］，而生長激素可加強腫瘤患者的代謝調(diào)理，改善患者細胞和體液性的全身防御能力［7］，促進創(chuàng)傷患者的正氮平衡、加速傷口愈合、減少并發(fā)癥，增加了患者對治療的耐受性并提高其療效［8］。

5－FU是一種天然存在的尿嘧啶的類似物，是臨床常用化療藥物。本研究選擇5－FU為實驗的陽性對照藥，是因5－FU作用于細胞周期的S期，與有關(guān)代謝物質(zhì)發(fā)生特異性的拮抗作用，對人乳腺癌細胞及消化道癌癥有較強的殺傷效果［9］，本研究證實了這一觀點。本研究結(jié)果顯示，對照組與rhGH組間的各項指標無顯著性差異（均P＞0.05），表明人生長激素在體內(nèi)對人乳腺癌細胞既無明顯的增殖作用，也無明顯的凋亡作用；rh GH＋5－FU組的腫瘤質(zhì)量、PI及G2M期的指標數(shù)值明顯小于5－FU組，G0／G1期的指標數(shù)值明顯大于5－FU組（均P＜0.05），揭示rhGH不影響5－FU對人乳腺癌細胞生長的抑制作用，即不影響化療藥物的抗癌作用，且產(chǎn)生協(xié)同作用，與文獻報道相符［10］。產(chǎn)生協(xié)同作用的機制為rh GH可下調(diào)乳腺癌細胞株MCF－7的Cyclin D基因表達，加強了5－FU對細胞周期G0－G1期的阻滯作用，大大減弱了S期DNA合成和細胞增殖的作用，這種作用一直延續(xù)到G2－M期，致使細胞分裂的作用也大大減弱，這就是rhGH與5－FU聯(lián)合比單用5－FU更好的原因。此外，有文獻報道指出rh GH可以有效提高射線對乳腺癌細胞的放射敏感性［11］。本研究結(jié)果為rh GH可安全應(yīng)用于人乳腺癌患者的治療提供了實驗依據(jù)，同時也為rh－GH聯(lián)合化療藥物應(yīng)用于臨床惡性腫瘤患者的治療提供了理論依據(jù)。

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