EPO對心肺復(fù)蘇后大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡、Bcl－2及Bax表達的影響

孫曉佳，孫 宇，孫 霓，王勝軍，李秀江＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 重癥監(jiān)護科，吉林 長春 130021；2.吉林省腫瘤醫(yī)院 重癥監(jiān)護科，吉林 長春 130012）

隨著心肺復(fù)蘇術(shù)的發(fā)展國內(nèi)外文獻報道心肺復(fù)蘇成功率有所提高，但腦復(fù)蘇率未見明顯提高。其根源在于腦組織未能及時得到保護治療。因此，心肺復(fù)蘇是決定預(yù)后的基礎(chǔ)，腦復(fù)蘇則是決定預(yù)后的關(guān)鍵。究其機制與缺血缺氧及再灌注損傷與神經(jīng)存活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及神經(jīng)元的凋亡有密切關(guān)系。文獻報道EPO對神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和抗凋亡的雙重作用，但其作用機制仍未完全明了。國內(nèi)尚無從心肺復(fù)蘇角度探討EPO的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡機制的研究，本實驗觀察EPO對心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、Bcl－2及Bax表達的影響，以探討心肺復(fù)蘇后神經(jīng)元損傷及促紅細(xì)胞生成素的保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康Wistar雄性大鼠32只，無菌級，體重220－270 g，由吉林大學(xué)實驗動物部提供。飼料為繁育鼠全價固體顆粒飼料，吉林大學(xué)實驗動物部提供。EPO沈陽三生制藥股份公司提供。原位末端標(biāo)記檢測（TUNEL）試劑盒、Bcl－2兔多克隆抗體、Bax鼠單克隆抗體購于SantaCurz公司，SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。水合氯醛、PBS及其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及動物模型制作 健康Wistar雄性大鼠32只，隨機分4組，每組8只。正常對照組（A組）、假手術(shù)組（B組）、心肺復(fù)蘇模型組（C組）、EPO干預(yù)組（D組）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉（300 mg／kg）后，分離并切開氣管，行氣管插管術(shù)連接動物呼吸機，設(shè)置容量控制模式，呼吸頻率70次／min，潮氣量8 ml／kg；分離右側(cè)頸總動脈，插導(dǎo)管，連接多導(dǎo)生理儀用Pclab軟件傳導(dǎo)并監(jiān)測血壓、心電圖；分離左側(cè)頸總靜脈留置輸液管。A組不給予任何處置。C、D組手術(shù)操作完成后，穩(wěn)定10 min，然后在呼氣末夾閉氣管使大鼠窒息7－9 min，在當(dāng)大鼠收縮壓≤30 mm Hg并出現(xiàn)心臟停搏時［1］，立即開放呼吸機，吸入100%純氧，胸外按壓，當(dāng)大鼠出現(xiàn)自主心律、脈搏波、收縮壓≥60 mm Hg，并持續(xù)10 min以上判定為自主循環(huán)恢復(fù)（re－turn of spontaneous circultion，ROSC），必要時予腎上腺素或多巴胺協(xié)同復(fù)蘇。C組心肺復(fù)蘇同時給予EPO 3000U／kg左側(cè)頸總靜脈注射。B組僅給予等劑量生理鹽水左側(cè)頸總靜脈注射。

1.2.2 標(biāo)本采集與組織學(xué)檢查 4 h后給予全部存活大鼠10%水合氯醛過量麻醉，用37℃生理鹽水250 ml經(jīng)心臟灌注快速沖洗去除血細(xì)胞，再用4℃多聚甲醛250 ml灌注固定后斷頭取腦，經(jīng)4%多聚甲醛后固定24－48 h后，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察組織學(xué)變化。

1.2.3 原位細(xì)胞凋亡檢測 步驟：①標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟水化；②配制新鮮3%H2O2室溫孵育10 min；③稀釋新鮮Proteinase K37℃消化10 min；④加標(biāo)記液，37℃標(biāo)記2h；⑤加封閉液室溫30 min；⑥加生物素化抗地高辛抗體37℃反應(yīng)30 min；⑦加SABC，37℃反應(yīng)30 min；⑧DAB顯色；⑨蘇木素輕度復(fù)染，脫水、封片，顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片取5個高倍鏡視野（400×）計數(shù)，取平均值，為該切片凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 Bcl－2、Bax免疫組織染色 步驟：①標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟水化；②3%H2O2室溫孵育15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；③0.1%TBS中行微波抗原修復(fù)10 min；④正常山羊血清室溫孵育15 min，封閉非特異性抗原；⑤滴加滴加一抗，（1∶100），4℃過夜；⑥滴加生物標(biāo)記二抗37℃孵育20 min；⑦滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育20 min；⑧DAB顯色；⑨水洗、復(fù)染、封片、光鏡下觀察?？瞻讓φ諏嶒炗肞BS代替抗體。Bcl－2陽性細(xì)胞胞漿／胞膜被染成棕黃色，每張切計數(shù)5個高倍鏡視野（400×），取平均值，為該切片陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSSn.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s±s）表示。兩組間樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，組間比較采用成組單因素方差分析。以P＜0.01為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)染色結(jié)果HE染色

A、B組海馬神經(jīng)細(xì)胞未見明顯的形態(tài)學(xué)改變，C組海馬神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變明顯，細(xì)胞變小、有固縮，核呈三角形、條形、有固縮，核仁濃縮。D組可見部分細(xì)胞固縮，核仁濃染，但缺血性改變較輕。

2.2 原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

A、B組未見陽性細(xì)胞，C組可見陽性細(xì)胞，其細(xì)胞核中有大量棕黃色顆粒。高倍鏡下可見到細(xì)胞核周質(zhì)靠近胞膜處有數(shù)個散在的深染的圓形顆粒狀結(jié)構(gòu)，即凋亡小體。C組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于A、B組，比較有顯著差異（P＜0.01）。D組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯低于C組，比較有顯著性差異（P＜0.01）。

2.3 Bcl－2、Bax的表達結(jié)果

A組和B組可見少量Bcl－2、Bax陽性細(xì)胞，兩組間比較差異無顯著性（P＞0.01）。C組可見較多Bcl－2、Bax陽性細(xì)胞表達，與A組和B組相比，有顯著性差異（P＜0.01）。D組Bcl－2陽性細(xì)胞表達高于C組，差異有顯著性（P＜0.01）。D組Bax陽性細(xì)胞表達低于C組，差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

心肺復(fù)蘇后引起腦組織損傷的原因很多，但主要為心跳驟停期間組織嚴(yán)重缺血缺氧以及復(fù)蘇后再灌注所致，再灌注損傷時，氧自由基的大量增加及細(xì)胞凋亡的激活被認(rèn)為是損傷發(fā)生的重要機制，目前認(rèn)為抑制復(fù)蘇后發(fā)生的細(xì)胞凋亡的激活是改善復(fù)蘇后腦組織功能的途徑之一。EPO屬于細(xì)胞因子超家族中的一員，除刺激造血外，還具有抗凋亡及細(xì)胞保護的作用［2，3］，是近年來研究較多的一個指標(biāo)。EPO及EPOR廣泛存在各種組織中，包括神經(jīng)系統(tǒng)。研究表明，EPO對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、保護和修復(fù)具有重要作用［4］，在體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)中Hasselblatt等［5］發(fā)現(xiàn)EPO可抑制谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡。本實驗可見C組海馬神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞變小、有固縮，核呈三角形、條形、固縮，核仁濃縮，缺血性改變明顯。D組可見部分細(xì)胞固縮，核仁濃染，但缺血性改變較C組輕。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果可見D組凋亡細(xì)胞數(shù)較C組減少，說明EPO可抑制大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

bcl－2、bax是己經(jīng)明確的參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的基因。bcl－2是重要的凋亡抑制基因，其基因產(chǎn)物Bcl－2與促凋亡基因bax的基因產(chǎn)物Bax相結(jié)合形成異源二聚體可產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax自身形成同源二聚體時可加速細(xì)胞凋亡。因此Bcl－2和Bax蛋白含量的比值決定細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生的過程［6－8］。結(jié)合本實驗A、B組大鼠海馬組織可見少量Bcl－2、Bax陽性細(xì)胞，C組與 A、B組相比較Bcl－2陽性細(xì)胞數(shù)增加，表明腦缺血再灌注損傷可以產(chǎn)生保護性細(xì)胞因子，從而上調(diào)bcl－2的表達抑制細(xì)胞凋亡；D組Bcl－2陽性細(xì)胞顯著多于C組，說明EPO能上調(diào)Bcl－2表達，減輕腦組織的凋亡。同時D組Bax陽性細(xì)胞顯著少于C組，表明EPO可以下調(diào)Bax的表達，降低Bax對凋亡的促進作用，從而保護腦組織。

表1 4組大鼠腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、Bcl－2和Bax表達情況

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