胎球蛋白－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響

馮娜娜，陶 婷

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 老年病科，上海 200025）

脂肪分解是人體能量代謝的核心反應(yīng)之一。當(dāng)機(jī)體有能量需求時(shí)，甘油三酯在特異性的脂肪酶的作用下分解為甘油和脂肪酸為機(jī)體提供能量。如果人體脂肪分解出現(xiàn)障礙，就會(huì)影響機(jī)體能量的平衡進(jìn)而引發(fā)肥胖和胰島素抵抗等疾病。Fetuin－a是存在于正常哺乳動(dòng)物血清中的一種糖蛋白，是胰島素受體酪氨酸激酶天然的抑制劑［1］。人的fetuin－a基因位于3號(hào)染色體q27位點(diǎn)上，該位點(diǎn)與代謝方面疾病密切相關(guān)［2］。Mathews ST等研究發(fā)現(xiàn)，fetuina基因敲除的小鼠能夠抵抗高脂飲食引起的肥胖［3］；而臨床研究表明體內(nèi)fetuin－a的升高與肥胖發(fā)生密切相關(guān)［4］。但目前fetuin－a與肥胖相關(guān)的分子機(jī)制尚并不清楚。本研究旨在探討fetuin－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3－L1前脂肪細(xì)胞株購自美國ATCC，牛血清胎球蛋白（fetuin－a）購自 Calbiochem 公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購自PAA Laboratories Gmb H公司；地塞米松購自Merck公司；甘油檢測(cè)試劑盒、甘油標(biāo)準(zhǔn)品、1－甲基－3－異丁基黃嘌呤（IBMX）購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen公司；Oligo（d T）Primer、d NTP、M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；Real－time PCR試劑盒購自Takara公司；引物由Invitrogen公司合成；Phospho－HSL（Ser563）、ATGL、β－actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz公司；CAMP ELISA試劑盒購自R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化3T3－L1前脂肪細(xì)胞用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合后2 d，加入誘導(dǎo)液 A（10%FBS高糖 DMEM，含0.5 m M IBMX、1μM 地塞米松、10μg／ml胰島素）開始誘導(dǎo)。2天后，換成誘導(dǎo)液B（10%FBS高糖DMEM含10μg／ml胰島素）。2天后重新?lián)Q10%FBS高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液一次。誘導(dǎo)分化8天，細(xì)胞90%以上呈成熟脂肪細(xì)胞表型，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 甘油含量測(cè)定 分化成熟的脂肪細(xì)胞，以含0.2%牛血清白蛋白的DMEM孵育過夜，PBS洗3遍，加入含有不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h。用甘油檢測(cè)試劑盒測(cè)定各處理組培養(yǎng)液中的甘油濃度作為脂解率的指標(biāo)，操作方法嚴(yán)格按照甘油檢測(cè)試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.3 Real－time PCR測(cè)定 ATGL m RNA 的表達(dá)細(xì)胞分化成熟后用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，用Trizol試劑提取脂肪細(xì)胞總RNA。定量后取總RNA 2μg，以O(shè)ligo（d T）為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μl。按SYBR green PCR master mix試劑盒的說明書進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，所用ATGL引物序列為：上游引物：5’－CGTCACCTGTGCCTTACTC－3’，下游引 物：5’－GGGCTCAAACTCCCAAAC－3’。 用 βactin作為內(nèi)參校正，采用相對(duì)定量方式表示各樣本目的基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot測(cè)定 HSL、ATGL蛋白表達(dá)細(xì)胞分化成熟后用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）的fetuin－a孵育12 h后，PBS洗3遍，再用蛋白提取裂解液裂解細(xì)胞，13 000×g離心20 min，吸取上清進(jìn)行蛋白定量。取50μg樣品進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，通過電泳儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h，再用5%脫脂奶粉稀釋一抗4℃雜交過夜，TBST（20 mmol／L Tris·HCl，p H 7.6；150 mmol／L NaCl；0.1%Tween20）洗3次，每次10 min；5%脫脂奶粉稀釋二抗，孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后以化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。ImageJ分析電泳條帶密度值，目的蛋白表達(dá)水平以該條帶密度占β－actin條帶密度的百分比（%）表示。

1.2.5 c AMP濃度檢測(cè) 分化成熟的細(xì)胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，棄掉上清，PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，按照c AMP ELISA檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞內(nèi)c AMP進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得的結(jié)果用總蛋白校正，數(shù)值以c AMP pmol／mg protein表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Fetuin－a抑制3T3－L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪分解

根據(jù)同類研究和本研究預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，12 h是fetuin－a抑制脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)脂肪分解的有效時(shí)間點(diǎn)。分化成熟的脂肪細(xì)胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40 μM）fetuin－a孵育12 h后，測(cè)定培養(yǎng)液中的甘油釋放量作為脂解率的指標(biāo)。如圖1所示，隨著fetuin－a濃度的增加，脂肪細(xì)胞的甘油釋放顯著降低，并具有劑量依賴關(guān)系（P＜0.05）。其中40μM fetuin－a作用最顯著，能使脂肪分解下降約61%。

2.2 Fetuin－a對(duì)ATGL mRNA表達(dá)的影響

分化成熟的脂肪細(xì)胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取總 RNA，采用Real－time PCR法檢測(cè)目的基因的mRNA的表達(dá)。如圖2所示，與對(duì)照組相比fetuin－a能顯著抑制ATGL的 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。

2.3 Fetuin－a對(duì)脂肪分解相關(guān)酶 HSL、ATGL蛋白表達(dá)的影響

分化成熟的脂肪細(xì)胞用不同濃度（0、0.2、1、5、40μM）fetuin－a孵育12 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法檢測(cè)目的基因的蛋白表達(dá)。如圖3所示，與對(duì)照組相比fetuin－a能顯著抑制 HSL、ATGL的蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.05）。

2.4 Fetuin－a對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響

為了了解fetuin－a影響脂肪分解的可能機(jī)制，我們檢測(cè)了脂肪分解的經(jīng)典傳導(dǎo)通路－c AMP依賴的PKA通路。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，fetuin－a作用12 h，能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)c AMP的含量，并呈劑量依賴關(guān)系（P＜0.05，見圖4）。40μM fetuin－a使細(xì)胞內(nèi)c AMP的含量下降最顯著，34%左右。

3 討論

圖1 Fetuin－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞脂肪分解的影響

圖2 Fetuin－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞ATGL mRNA表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)的主要目的在于研究fetuin－a對(duì)脂肪分解的影響及其機(jī)制。Fetuin－a是存在于正常哺乳動(dòng)物血清中的一種糖蛋白，其最初從牛血清中分離提純獲得，胚胎期可由肝臟、胰臟、腎臟等多種組織器官合成分泌，成年后則主要由肝臟合成分泌入血清［5］。人的fetuin－a基因位于3號(hào)染色體q27位點(diǎn)上，該位點(diǎn)與代謝方面疾病密切相關(guān)［2］。在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較肥胖小鼠血清fetuin－a的含量明顯增加。Fetuin－a敲除的小鼠給予高脂飲食時(shí)，與正常小鼠比較脂肪沉積明顯減少并能抵抗由此引起的肥胖［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，fetuin－a升高與內(nèi)臟脂肪沉積有關(guān)［6］。病人在體重減輕后，血清中fetuin－a也明顯降低［7］。Chen HY等人發(fā)現(xiàn)在非糖尿病血透病人中，血清中fetuin－a水平最高組軀干肥胖的發(fā)生率是最低組的3.2倍［4］。以上研究提示fetuin－a與肥胖有關(guān)。脂肪分解異常會(huì)導(dǎo)致肥胖，皮下脂肪組織中兒茶酚胺誘導(dǎo)的脂肪分解受損是肥胖患者的一個(gè)常見特征［8，9］。本研究通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的甘油釋放量證實(shí)fetuin－a以劑量依賴的方式抑制脂肪細(xì)胞的脂肪分解，表明fetuin－a是脂肪分解的重要的抑制因子。

圖3 Fetuin－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞phospho－HSL和ATGL蛋白表達(dá)的影響

圖4 Fetuin－a對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響

HSL是經(jīng)典的脂肪分解反應(yīng)限速酶，其表達(dá)水平降低及活性減弱均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂肪分解率下降。機(jī)體通過c AMP－PKA通路調(diào)節(jié) HSL的活性，c AMP是該信號(hào)通路中的重要的第二信使。在激素的作用下Gs偶聯(lián)的受體被激活，從而激活c AMP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)c AMP水平增加，進(jìn)而激活PKA。PKA使HSL磷酸化，磷酸化的HSL從胞漿向脂滴表面轉(zhuǎn)位從而分解脂滴內(nèi)甘油三酯［10］。本實(shí)驗(yàn)通過western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化HSL的含量，通過ELISA檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞中c AMP的含量。結(jié)果表明，fetuin－a能夠降低細(xì)胞內(nèi)c AMP及磷酸化HSL的含量。據(jù)此推測(cè)，fetuin－a通過降低細(xì)胞中c AMP的含量，抑制了細(xì)胞中HSL的磷酸化過程，從而抑制了脂肪細(xì)胞的脂肪分解。

ATGL是體內(nèi)脂肪分解的另一種限速酶，已證實(shí)ATGL主要水解甘油三酯為甘油二酯，其與HSL共同提供體內(nèi)大約95%的脂肪水解活性［11］。其表達(dá)水平降低同樣會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂肪分解率下降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fetuin－a能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)ATGL m RNA及蛋白的表達(dá)，推測(cè)這與fetuin－a抑制脂肪分解相關(guān)。

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