高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中五種防腐劑的研究

王 麗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寶雞市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 寶雞 721000)

0 引言

食品是人類生存的基礎(chǔ)，添加適量的防腐劑是防止食品腐敗變質(zhì)最通用的方法；但過量或非法的添加在一定程度上危害人體健康，甚至威脅人類生命[1].因此，食品防腐劑的安全性及檢測(cè)方法已成為焦點(diǎn),各個(gè)國(guó)家的研究者都在努力尋求有效便捷的食品防腐劑檢測(cè)方法[2-4].

苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類是目前食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛的添加劑[5].GB/T5009.29-2003記載了果汁等苯甲酸、山梨酸的測(cè)定方法為氣相色譜法、薄層色譜法和高效液相色譜法，但檢測(cè)范圍有限[6]；GB/T5009.121-2003采用氣相色譜法檢測(cè)腐乳、醬菜等食品中脫氫乙酸含量，樣品前處理繁冗[7].并且國(guó)標(biāo)只能針對(duì)某種食品中的一類防腐劑進(jìn)行測(cè)定，而同時(shí)測(cè)定食品中5種防腐劑的方法也鮮見報(bào)道.

現(xiàn)今食品防腐劑的種類及適用范圍不斷增加，添加方法不斷變更，過于單一的檢驗(yàn)方法已不能完全滿足當(dāng)前檢驗(yàn)工作的需要[8-10].本文采用高效液相色譜法對(duì)食品中苯甲酸等5種防腐劑同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)化樣品前處理程序，提高了檢測(cè)效率，獲得較好的檢測(cè)效果.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 儀器

日本島津高效液相色譜儀(SHIMADZU CLASS-VP l0AT)，美國(guó)安捷倫色譜柱(TC-C18)，梅特勒一托利多電子天平(AL104)，江蘇昆山超聲波清洗器(KQ3200)，天津奧特賽恩斯手提式真空泵(SCIENCE AP-O1)，上海安亭臺(tái)式離心機(jī)(TDL-4)，大龍手動(dòng)可調(diào)式移液槍等.

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(含量>99.0%，天津科密歐).

試劑：乙醇、乙腈(含量為99.9%，上海國(guó)藥集團(tuán))；乙酸銨、乙酸鋅、石油醚、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀等化學(xué)試劑(分析純，天津科密歐)；瓶裝純凈水(娃哈哈).

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相A相為100%乙腈，B相為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，采用梯度洗脫程序，如表1所示；流速：1.000 mL/min；柱溫：35 ℃；波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10μL.

表1 防腐劑的液相色譜的洗脫梯度

1.3 試劑配制

單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯及對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g，用乙醇溶解并定容至50 mL，終濃度為1 mg/mL， 4 ℃保存.

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別用移液槍吸取上述防腐劑單標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，即得防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為100 mg/L.用乙醇逐級(jí)稀釋至一系列濃度：10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L ，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L.

1.4 樣品前處理

液體樣品：取5 mL樣品于50 mL比色管中，調(diào)pH6-7后，加入30 mL蒸餾水稀釋，如樣品富含蛋白質(zhì)，加入2.5 mL乙酸鋅和2.5 mL亞鐵氰化鉀沉淀蛋白，純水定容至刻度后再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，收集濾液備用；如樣品富含脂肪，則烘干后用氫氧化鈉溶液調(diào)至堿性，反復(fù)加入石油醚脫脂，棄去石油醚層，將剩余物轉(zhuǎn)入容量瓶中，靜置分層，取上清液過0.22μm濾膜過濾，收集濾液備用.

固體樣品：稱取樣品5 g粉碎，若樣品中蛋白含量低，用水直接溶解并定容，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾，合并濾液備用；若蛋白含量高，則需先加入2.5 mL乙酸鋅和2.5 mL亞鐵氰化鉀來沉淀蛋白，收集上清液再定容至所需刻度.

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

min圖1 五種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖

因所測(cè)樣品可溶于水相中，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的條件，選用Agilent TC-C18色譜柱進(jìn)行分析.

2.1.2 檢測(cè)器波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)上述5種防腐劑的單一標(biāo)液進(jìn)行掃描，測(cè)得苯甲酸的最大吸收峰在228 nm處；山梨酸的最大吸收峰在260 nm處；脫氫乙酸在234 nm處；對(duì)羥基苯甲酸甲酯及對(duì)羥基苯甲酸乙酯均在254 nm處；而5種防腐劑在254 nm波長(zhǎng)處有共同較大吸收峰.故確定254 nm為程序的測(cè)定波長(zhǎng).

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

分別使用甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相洗脫樣品，結(jié)果表明在乙腈-水的流動(dòng)相體系中5種防腐劑可以取得較好的色譜分離效果.

實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水作為流動(dòng)相體系，對(duì)水相的pH值和緩沖液濃度進(jìn)行考察，結(jié)果表明在水相中添加0.02 mol/L乙酸銨的緩沖鹽，可以有效控制流動(dòng)相的pH波動(dòng)，使所測(cè)5種防腐劑分開.由于苯甲酸與山梨酸的保留時(shí)間相近，而苯甲酸、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸甲酯之間的性質(zhì)相差較大，為保持良好的分離度，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，詳情如表1所示.

2.1.4 柱溫的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，液相色譜檢測(cè)器的溫度對(duì)防腐劑的測(cè)定結(jié)果影響作用較微.但為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精密準(zhǔn)確，本方法檢測(cè)時(shí)控制柱溫在35 ℃左右.

2.2 方法的評(píng)價(jià)

2.2.1 色譜分離效果

分別取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)液及以上5種防腐劑的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示.結(jié)果顯示：采用高效液相色譜法，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，方法專屬性較高，5種防腐劑都達(dá)到了較好的分離效果，且在9 min內(nèi)得到了分離.

2.2.2 線性關(guān)系及檢出限

將苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)液配制成0.01～40 mg/L的一系列梯度濃度，按上述優(yōu)化后的色譜條件分別測(cè)定，采集信號(hào)，并繪制出對(duì)應(yīng)線性曲線，計(jì)算曲線的相關(guān)系數(shù)，以信噪比(S/N)等于3作為方法的檢出限，測(cè)定最低檢出限，結(jié)果如表2所示.

由表2可以看出，采用高效液相色譜法測(cè)定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸乙酯，方法在一定范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，方法的最低檢出限在0.065～0.601 mg/kg之間，其中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的最低檢出濃度為0.065 mg/kg,苯甲酸的最低檢出濃度為0.601 mg/kg.

2.2.3 精密度與準(zhǔn)確度

取不含待測(cè)組分的同一樣品，平行稱取3份樣，分別加入分高、中、低3個(gè)濃度水平的苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯以及對(duì)羥基苯甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)液.按照前處理方法進(jìn)行處理，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，測(cè)其回收率和精密度.結(jié)果如表3所示.

表2 防腐劑的液相色譜方法的線性及檢出限

表3 檢測(cè)方法的精密度和準(zhǔn)確度

由表3可以看出，采用高效液相色譜法測(cè)定苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯及對(duì)羥基苯甲酸乙酯，方法的平均回收率均在90%以上，其中苯甲酸的回收率較低為94.5%，對(duì)羥基苯甲酸乙酯的平均回收率最高為97.7%.相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.64～2.56%之間，其中脫氫乙酸最低為1.64%，對(duì)羥基苯甲酸乙酯最高為2.56%.結(jié)果基本達(dá)到了儀器測(cè)定分析法的要求.

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3.1 國(guó)標(biāo)法測(cè)定樣品中五種防腐劑的含量

隨機(jī)抽取寶雞地區(qū)市售陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜五類食品共11個(gè)樣品，分別為東湖老陳醋、海天威極老陳醋、金威啤酒、漢斯干啤、匯源橙汁、美汁源果粒橙、農(nóng)夫果園、李錦記老抽、家樂特鮮醬油、口口脆榨菜、烏江牌榨菜，經(jīng)前處理后，采用國(guó)標(biāo)方法分別測(cè)定其中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯的含量，共測(cè)定10次，結(jié)果如表4所示.

表4 國(guó)標(biāo)法測(cè)定食品中防腐劑含量

由表4可以看出，采用GB/T5009.29-2003食品中苯甲酸、山梨酸的測(cè)定方法，GB/T5009.31-2003 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定方法，GB/T5009.121-2003食品中脫氫乙酸的測(cè)定方法，對(duì)上述樣品中的防腐劑進(jìn)行測(cè)定，除東湖老陳醋含苯甲酸2.56 mg/kg，李錦記老抽含山梨酸2.95 mg/kg，家樂特鮮醬油含對(duì)羥基苯甲酸乙酯1.01 mg/kg外，其它防腐劑均未檢出.

2.3.2 高效液相色譜法測(cè)定樣品中五種防腐劑的含量

采用本文研究的高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定寶雞地區(qū)市售陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜五類食品共11個(gè)樣品中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯的含量，結(jié)果如表5所示.

由表5 可以看出，一些通過國(guó)標(biāo)規(guī)定方法測(cè)定不出含有防腐劑的樣品，通過高效液相色譜同時(shí)測(cè)定法則可以測(cè)定出防腐劑的存在.如通過高效液相色譜同時(shí)測(cè)定法可以測(cè)出樣品海天威極老陳醋含有少量的苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸；樣品李錦記老抽除含有山梨酸外，還存在部分脫氫乙酸；樣品家樂特鮮醬油除含有對(duì)羥基苯甲酸乙酯外，還含有山梨酸、脫氫乙酸以及對(duì)羥基苯甲酸甲酯；樣品烏江牌榨菜含有脫氫乙酸及對(duì)羥基苯甲酸乙酯，而上述防腐劑由于其含量小，通過國(guó)標(biāo)法均未測(cè)出，由此可見本論文研究的高效液相色譜法與國(guó)標(biāo)法相比，靈敏度更高，檢測(cè)限更低，本法可以用作食品中是否含有防腐劑的定性檢測(cè)方法.

表5 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中防腐劑含量

3 結(jié)束語

本文建立了食品中山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯這5種防腐劑的高效液相色譜測(cè)定法，并且確定了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、靈敏度、線性范圍.防腐劑檢測(cè)限在0.078～0.601 mg/L之間，回收率均在90%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%.與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法相比，該法回收率高、重現(xiàn)性好、線性范圍合適，且檢測(cè)限較低，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)食品中這5種防腐劑同時(shí)檢測(cè)目的；實(shí)際檢測(cè)陳醋、啤酒、果汁、醬油、榨菜等食品樣品，方法回收率及重現(xiàn)性均很好.因此，作為一種分析測(cè)試方法，本法可以作為食品中是否含有以上5種防腐劑的定性判定方法，但是要作為一種通法代替國(guó)標(biāo)法測(cè)定食品中防腐劑，尚需大量實(shí)驗(yàn)研究及測(cè)試.

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