果膠酶提取大棗多糖的工藝研究

楊 輝， 閆明明

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

大棗多糖是大棗中重要的生物活性物質(zhì)，可作為免疫促進(jìn)劑，能控制細(xì)胞的分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和衰老.可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能食品，作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品具有廣闊的市場前景.

目前，大棗多糖的提取研究較多，尚紅偉[1]等利用水提醇沉法進(jìn)行大棗多糖的提取，石奇[2]等利用超聲波法對大棗多糖的提取進(jìn)行了研究，林勤保[3]等分別采用熱水浸提、微波和超聲波強(qiáng)化等方法提取大棗多糖.

此外，采用酶法提取大棗多糖也有研究，楊云[4]等分別利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等對大棗多糖進(jìn)行提取，得出復(fù)合酶2(先胰蛋白酶提，后木瓜蛋白酶提)效果最好；石奇[5]等利用中性蛋白復(fù)合酶法對大棗多糖的提取進(jìn)行了研究；邱承軍[6]等用木瓜蛋白法進(jìn)行脫蛋白提取大棗多糖，都取得較好的效果，但以上酶法提取的研究對大棗多糖果膠含量高的特性考慮不足，針對這一特點(diǎn)，本文對果膠酶法提取大棗多糖的工藝進(jìn)行了研究，并以響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝.響應(yīng)面法是優(yōu)化工藝較好的方法，其優(yōu)點(diǎn)是在試驗條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對試驗因素的各個水平進(jìn)行分析，克服了正交試驗只能對一個個孤立的試驗點(diǎn)進(jìn)行分析的缺點(diǎn).蔣水星[7]等采用響應(yīng)面法對大棗多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但該工藝不是酶法提取.因此，本文的研究可對高效提取大棗多糖提供新的參考.

1 實驗材料與方法

1.1 原料

陜西省佳縣有機(jī)烘干棗.

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平、722型分光光度計、恒溫水浴鍋、攪拌器、漩渦混勻器、干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、多功能粉碎機(jī).

1.3 試劑與溶液的配制

(1)葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇等均為分析試劑，果膠酶.

(2)6%苯酚溶液的配制:稱取苯酚6.000 2 g，加94 mL蒸餾水，混勻，避光，冷藏.

(3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取于105 ℃烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.200 1 g，將其定容到200 mL的容量瓶中，得到濃度為0.100 05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.4 實驗方法

1.4.1 大棗含水量的測定

取一定質(zhì)量大棗(帶核)，用粉碎機(jī)粉碎至顆粒小于2 mm，準(zhǔn)確稱取粉碎后大棗m1，置于101～105 ℃干燥箱中，干燥至恒重，稱得棗粉m2，則大棗含水量為：(m1-m2)/m1×100%.

1.4.2 多糖的測定

采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品.

1.4.3 多糖提取率的計算

多糖提取率：M2/M1×100%，其中，M1為大棗原料質(zhì)量(g)，以干重計算；M2為多糖質(zhì)量(g).

1.4.4 大棗多糖提取工藝路線

稱取一定質(zhì)量的烘干棗，以大棗和水比例為1∶6加水，于90 ℃水浴攪拌20 min，破皮，冷卻后加入果膠酶酶解一次，然后過濾并離心得上清液，加乙醇使其濃度為80%，醇沉4 h，離心，沉淀加水復(fù)溶，得到大棗粗多糖.其工藝流程如下：

烘干棗→加水(以干重和水比例為1∶6)，90 ℃水浴20 min，攪拌破皮→冷卻，加酶→恒溫培養(yǎng)→90 ℃滅酶20 min→過濾，離心→上清液加乙醇醇沉4 h(最終使乙醇濃度為80%)→離心得粗多糖.

2 結(jié)果與分析

2.1 大棗含水量

稱得烘干前棗粉重量m1為2.937 7 g，烘干后棗粉重量m2為1.832 4 g，則大棗含水量為37.63%.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2及1.4 mL，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.6 mL及濃硫酸7.0 mL，混合均勻后，室溫靜置20 min，于490 nm測吸光度(A).以糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線.其線性回歸方程為A=12.011c-0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1.

2.3 果膠酶影響多糖提取的機(jī)理

大棗中含有多糖，存在于大棗皮、果肉之中，在水中有一定的溶解度，因此，常常采用水提醇沉法獲取大棗多糖.大棗含有大量的膠質(zhì)類物質(zhì)，在水浸泡和蒸煮過程中產(chǎn)生膠體溶液，增大了傳質(zhì)阻力，使多糖類物質(zhì)不易溶解在水中，采用果膠酶酶解使膠質(zhì)分解，破壞膠體溶液的穩(wěn)定性，降低大棗提取液的粘度，加速大棗多糖的傳質(zhì)過程，因而，可提高大棗多糖的提取率.

2.4 單因素試驗

影響酶提的因素有很多，主要有pH、酶加量、提取溫度及提取時間等，考慮到本研究是和棗酒生產(chǎn)相結(jié)合，即提取大棗多糖后的棗泥再進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵，然后通過蒸餾生產(chǎn)白蘭地酒，而pH的調(diào)節(jié)勢必要引入緩沖液等化學(xué)試劑,影響產(chǎn)品安全性.因此，重點(diǎn)考察剩下的3個因素，即取破皮后大棗溶液(去核)，每份100 mL，然后選用酶加量、提取時間和提取溫度3個對多糖提取有影響的因素，以大棗多糖的吸光度為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗.

2.4.1 酶加量對多糖提取率的影響

在溫度45 ℃，提取時間80 min條件下，考察酶加量對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 酶加量對多糖提取率的影響

酶應(yīng)用于植物多糖提取中，主要是通過酶促反應(yīng)，借助酶的參與來降低提取體系中的活化能，使整個反應(yīng)在較低能量水平上進(jìn)行，易于多糖從原料中釋放出來.根據(jù)酶促反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，在一定范圍內(nèi)，隨著酶濃度的增加，反應(yīng)速率加快.據(jù)此本研究中果膠的有效轉(zhuǎn)化隨著果膠酶濃度的增加而增加，多糖浸出的阻力減小，促使多糖的提取率隨之增大.而當(dāng)果膠酶濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于果膠濃度時，酶對整個反應(yīng)就不僅僅意味著只將底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，因果膠酶中含有少量其他的酶，還會將多糖轉(zhuǎn)化為非目標(biāo)產(chǎn)物，從而導(dǎo)致其多糖得率降低.因此，反應(yīng)存在一個最佳酶用量.從圖1可以看出，隨著酶加量的增加，吸光度是先增加后減小，在酶加量為0.5 g/10 L時達(dá)到最大.

2.4.2 提取時間對多糖提取率的影響

當(dāng)提取溫度45 ℃，酶加量為0.5 g/10 L時，考察提取時間對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

從圖2可以看出，在溫度和酶加量一定的情況下，隨著酶提時間的增加，其吸光度逐漸減小，這表明多糖的浸出過程和時間密切相關(guān).時間過短，不足于降低多糖浸出的阻力，使其從原料中完全溶出，而時間過長又會使溶出的多糖部分或全部被分解掉，導(dǎo)致其提取率降低.

2.4.3 提取溫度對多糖提取率的影響

酶加量0.5 g/10 L，提取時間為40 min的情況下，考察不同溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示.

溫度對酶促反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)分子擴(kuò)散有雙重影響，即未達(dá)到酶的最適溫度前，溫度升高能增加包括酶和底物分子在內(nèi)的整個溶液體系的能量，既可使細(xì)胞內(nèi)活性分子的運(yùn)動速度加快，有利于其從細(xì)胞內(nèi)向溶液擴(kuò)散，又可提供酶促反應(yīng)所需的熱能，使酶的作用加強(qiáng)，進(jìn)一步促使目標(biāo)產(chǎn)物從胞內(nèi)溶出，故這段時間內(nèi)，多糖的提取率和溫度成正相關(guān).然而當(dāng)溫度繼續(xù)升高，超過酶的最適溫度后，將導(dǎo)致維系酶三維結(jié)構(gòu)的多重非共價鍵(氫鍵、范德華力等)破裂，使酶部分甚至全部變性，酶促反應(yīng)受到抑制，從而導(dǎo)致多糖的提取率降低.

從圖3可以看出，隨著溫度的升高，多糖的吸光度是先增加后減小，在50 ℃達(dá)到最大，因此其最佳酶活應(yīng)該在50 ℃左右.

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.5 響應(yīng)面試驗

2.5.1 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選用酶加量(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)等3個對大棗多糖提取率有影響的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法求取優(yōu)化的工藝參數(shù)，試驗因素與水平設(shè)計如表1所示.

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.5.2 響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶提取大棗多糖的工藝

以A、B、C為自變量，多糖吸光度為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

其中1～12是析因試驗，13～15是中心試驗，用來估計實驗誤差.用Design-Expert軟件對響應(yīng)值和各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：

Y=0.402 667-0.014 263A+0.019 512B-0.008 95C-0.034 233AA-0.001 7AB-0.023 675AC-0.019 483BB+0.001 925BC-0.013 108CC

采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表3所示.

表3 回歸模型方差分析

注：R2=97.43%，*為差異顯著(P<0.05)，**為差異極顯著(P<0.01).

由表3可知：一次項中A和B的偏回歸系數(shù)極顯著，說明酶加量及提取溫度對大棗多糖的得率有極顯著影響，C的偏回歸系數(shù)顯著，說明時間對大棗多糖得率有顯著影響.

采用Design-Expert軟件根據(jù)多元回歸擬合分析處理的3個因素對大棗多糖提取率的響應(yīng)面分析結(jié)果如圖4～6所示.

等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱趨勢.由圖4～6可知，酶加量與提取時間交互作用顯著，提取時間與溫度、提取溫度與酶加量交互作用不顯著，與表3中交互項P值的分析結(jié)果一致.

通過對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到其最佳組合是酶加量0.5 g/10 L、提取溫度52.5 ℃、提取時間45 min，在此條件下，大棗多糖的理論吸光度是0.408 3.驗證實驗：在上述響應(yīng)面分析結(jié)果確定的最佳工藝條件下進(jìn)行3次提取實驗，得到大棗多糖的平均吸光度為0.406 5，在誤差允許范圍內(nèi).說明用響應(yīng)面法優(yōu)化大棗多糖的提取工藝是可行的.

圖4 酶加量和溫度對多糖提取率影響的響應(yīng)面值與等值線

圖5 酶加量和時間對多糖提取率影響的響應(yīng)面值與等值線

圖6 時間與溫度對多糖提取率影響的響應(yīng)面值與等值線

3 結(jié)束語

通過響應(yīng)面法優(yōu)化大棗多糖提取工藝是可行的.其優(yōu)化的大棗多糖較適宜的條件是：酶加量0.5 g/10 L、提取溫度52.5 ℃、提取時間45 min.考慮實際操作的精度，將多糖提取的最佳參數(shù)設(shè)定為：酶加量0.5 g/10 L、提取溫度52 ℃、提取時間45 min，在此條件下，用整烘干棗進(jìn)行提取，其得率(以干重計)為7. 29%.

由于本研究沒有分析酶中混雜的其他成分；同時，果膠酶的酶活也沒有進(jìn)行測定，這些對多糖的提取率有何影響，還有待于進(jìn)一步研究.

[1] 尚紅偉，樊 君，王華敏,等.大棗多糖的提取及其工藝條件的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(自然科版),2002,32(S1):150-152.

[2] 石 奇，楊曉慧，石 異,等.超聲波法提取大棗多糖工藝的研究[J].山西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,22(3):78-80.

[3] 林勤寶，趙國燕.不同方法提取大棗多糖工藝的優(yōu)化研究[J].食品科學(xué),2005,26(9):368-371.

[4] 楊 云，謝新年，孟 江,等.酶法提取大棗多糖的研究[J].食品工業(yè)科技, 2003,24(10):93-95.

[5] 石 奇，樊 君，石 異.中性蛋白復(fù)合酶法提取大棗多糖的研究[J].時珍國醫(yī)國藥, 2009,20(1):7-8.

[6] 邱承軍，姚文華.酶法脫蛋白提取大棗多糖工藝的研究[J].生物技術(shù)通報,2009,15(7):94-97.

[7] 蔣水星，陳雪峰，趙天殊.響應(yīng)面法優(yōu)化大棗多糖的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(6):3 652-3 654.